可見分光光度法測(cè)定偽魚腥藻與二形四鏈藻混合藻液生物量

引言

近期研究表明，偽魚腥藻(Pseudoanabaenasp.)普遍存在于南方的湖泊、水庫(kù)、河流和養(yǎng)殖池塘等水體，是銅綠微囊藻(Microcysisaeruginosa)以外又一常見的藍(lán)藻水華種，并已成為我國(guó)重要水體水華的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群，其細(xì)胞密度最高達(dá)到77.5%，在一些水庫(kù)中平均比例達(dá)22.75%。偽魚腥藻藻華使水體呈現(xiàn)灰紅色、產(chǎn)生異常嗅味的代謝物二甲基異次醇，分泌藻毒素導(dǎo)致動(dòng)物肝臟毒性等一系列毒性效應(yīng)，嚴(yán)重威脅水域生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定、養(yǎng)殖效益和人身健康，從而急需引起高度重視。

藻類生物量的監(jiān)測(cè)是防控水華發(fā)生的最基本依據(jù)。葉綠素a熒光定量法用于檢測(cè)藻類生物量，具有檢測(cè)周期短、時(shí)效性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但熒光定量法極易受藻團(tuán)大小、藻種結(jié)構(gòu)、環(huán)境因子條件變化影響，檢測(cè)結(jié)果可靠性和精確性成為葉綠素a定量檢測(cè)的瓶頸?？梢姺止夤舛确ǎㄟ^吸光度直接建立一元線性回歸方程，即可測(cè)定藻密度或葉綠素a濃度。熒光光度法和可見分光光度法檢測(cè)葉綠素a的比較研究表明，當(dāng)藻密度較低時(shí)，采用熒光分光光度法具有一定優(yōu)勢(shì)，而當(dāng)藻密度處在較高密度瀕臨水華狀態(tài)時(shí)，采用可見分光光度法表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。近年關(guān)于可見分光光度法測(cè)定葉綠素a含量的研究和應(yīng)用多局限于單一藻種，對(duì)包含多種藻類混合生物量的研究不多，僅見涂波等對(duì)6種微綠藻混合生物量的研究。采用可見分光光度法測(cè)定微藻不同門類混合藻液生物量的研究鮮見報(bào)道。應(yīng)用可見分光光度法檢測(cè)重要水體中臨近水華狀態(tài)條件下高密度、多種類藻類藻密度及葉綠素a濃度無疑是重要水體水華防控經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。

已有的研究表明，采用可見分光光度法測(cè)定水體中的藻類密度時(shí)，形態(tài)不規(guī)則的藻類含量與光密度的相關(guān)性較差，而形態(tài)規(guī)則的近球形藻種，相關(guān)性較好。二形四鏈藻(Tetradesmusdimorphus)，常以4個(gè)近長(zhǎng)橢圓形細(xì)胞組成群體形式存在;偽魚腥藻則常為不分枝絲狀，細(xì)胞圓柱形。在導(dǎo)致藻華的藻類中，偽魚腥藻最適生長(zhǎng)溫度在25℃左右，綠藻柵藻通常在較低水溫下易占優(yōu)勢(shì)，最適生長(zhǎng)溫度為25℃。而部分藍(lán)藻(如微囊藻等)的最適生長(zhǎng)溫度則高于25℃水溫，達(dá)到30～35℃，遠(yuǎn)高于綠藻和偽魚腥藻。因此，二形四鏈藻作為富營(yíng)養(yǎng)湖泊的綠藻門優(yōu)勢(shì)種，?？膳c偽魚腥藻共存。該研究通過室內(nèi)純種培養(yǎng)的偽魚腥藻和二形四鏈藻，研究其可見光光譜吸收特征，分析吸光度與單一及混合藻液細(xì)胞密度、葉綠素a濃度的相關(guān)性，探討重要水體水華發(fā)生的不同階段單一藻類生物量定量和自然水體多門類混合藻類生物量之間的相互關(guān)系，以期為進(jìn)一步研發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的水華預(yù)警技術(shù)提供參考。

1材料與方法

1.1藻種培養(yǎng)試驗(yàn)藻種偽魚腥藻(Pseudoanabaenasp.)和二形四鏈藻(Tetradesmusdimorphus)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。采用BG－11培養(yǎng)基，接種后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3500lx，光暗周期12h∶12h，溫度(25.0±0.5)℃。每日定時(shí)搖晃3次。培養(yǎng)至指數(shù)期，使藻密度達(dá)到106～107個(gè)/mL。

1.2藻種吸收光譜掃描偽魚腥藻和二形四鏈藻的吸光度使用紫外可見分光光度儀(UV－1100)測(cè)定，以蒸餾水調(diào)零，在400～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，掃描間隔為5nm。

1.3純種藻密度的相關(guān)性分析二形四鏈藻以4.7×106個(gè)/mL、偽魚腥藻以5.7×107個(gè)/mL為初始濃度。用移液槍吸取一定藻液，用蒸餾水稀釋至10mL，以此配制成稀釋倍數(shù)為0、2 .5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0的濃度梯度，每梯度3個(gè)平行，用蒸餾水調(diào)零。用上述2種藻液共同對(duì)應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定溶液OD值，每個(gè)樣測(cè)定3次，取平均值。每梯度藻細(xì)胞的密度，顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制片計(jì)數(shù)3次，取平均值。以此結(jié)果進(jìn)行稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與吸光度、吸光度與藻密度之間的相關(guān)性分析。

1.4純種藻葉綠素a的相關(guān)性分析取指數(shù)期上述2種藻液，用蒸餾水稀釋0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0倍，配制成不同濃度梯度，每梯度3個(gè)平行，取一定量體積，用whatman玻璃纖維濾膜(25mm)過濾，立即將濾膜對(duì)折于試管中，加入5mL95%的乙醇溶液，4℃冰箱中避光萃取24h，期間數(shù)次搖晃。將萃取后的上清液于恒溫離心機(jī)中以5000r/min離心10min，取上清液分別在波長(zhǎng)665、649nm下測(cè)吸光度，葉綠素a濃度的計(jì)算根據(jù)李合生［20］的方法進(jìn)行。同時(shí)對(duì)每梯度藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，方法同“1.3”。以此結(jié)果進(jìn)行葉綠素a濃度與藻密度之間的相關(guān)性分析。

1.5混合藻種藻密度與葉綠素a的相關(guān)性分析將“1.4”所配制的藻液濃度梯度，參考涂波等［13］的方法，各取一定體積1∶1等比例混合。在2種微藻共有的明顯吸收峰波長(zhǎng)處分別測(cè)定各濃度梯度下的OD值、總細(xì)胞密度、葉綠素a濃度，以此來研究藻種藻密度與葉綠素a之間的關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1兩種微藻的光吸收曲線從圖1可以看出，偽魚腥藻在440、575和680nm處有較大的吸收峰;二形四鏈藻在440nm處有較弱的吸收峰，在685nm處有最大的吸收峰;2種微藻在680nm左右均有明顯的吸收峰。

2.2藻種稀釋梯度與吸光度的相關(guān)性為驗(yàn)證不同吸收峰波長(zhǎng)下吸光度是否與藻密度有線性關(guān)系，分別在不同波長(zhǎng)下測(cè)定各藻液密度的吸光度。結(jié)果表明(表1)，2種藻液稀釋梯度(x)與其吸光度(y)之間均具有顯著線性相關(guān)(Ｒ2≥0.9996)，偽魚腥藻680nm的相關(guān)系數(shù)略高于440和575nm，二形四鏈藻在440、680、685nm的相關(guān)系數(shù)差異不顯著。將2種藻液按體積比1∶1混合后配制成不同濃度梯度，在共同吸收峰波長(zhǎng)680nm時(shí)，其稀釋梯度與混合藻液的吸光度之間仍具有顯著線性相關(guān)(Ｒ2=0.9997)。

2.3藻種吸光度與藻密度的相關(guān)性分析吸光度和藻密度之間的相關(guān)性(表2)，2種微藻在各自吸收峰處，吸光度(x)和藻密度(y)均存在顯著的線性相關(guān)(Ｒ2≥0.9993)，這表明在試驗(yàn)波長(zhǎng)條件下藻液的吸光度能夠反映藻液的藻細(xì)胞密度;但藻液在680nm處的Ｒ2略高于440nm處;在680nm處，混合藻液的吸光度與總藻細(xì)胞密度之間也具有顯著的線性相關(guān)(Ｒ2=0.9998)，說明OD680可以相對(duì)準(zhǔn)確地反映出試驗(yàn)藻混合藻液的細(xì)胞密度。

2.4藻種葉綠素a濃度與藻密度的相關(guān)性將偽魚腥藻和二形四鏈藻葉綠素a濃度與其對(duì)應(yīng)的藻密度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明(圖2)，2種藻液葉綠素a濃度與相應(yīng)藻密度之間具有顯著的線性相關(guān)(Ｒ2≥0.9944)，其回歸方程分別為y=883.53x+77.43和y=372.83x+15.23，可據(jù)此方程，依據(jù)藻密度得到相應(yīng)的葉綠素a濃度。將兩者1∶1混合后，總藻密度和葉綠素a濃度之間也存在顯著的線性相關(guān)(Ｒ2=0.9960，圖3)。因此，求得偽魚腥藻、二形四鏈藻及兩者混合后吸光度與葉綠素a之間的回歸方程分別為y=5.4750x、y=2.8288x、y=2.9673x，且方程相關(guān)系數(shù)Ｒ2≥0.9900，均有顯著的線性相關(guān)。這一結(jié)果表明可見分光光度法的OD680值可以相對(duì)準(zhǔn)確地反映出試驗(yàn)藻混合液的葉綠素a濃度。

3討論與結(jié)論

3.1可見分光光度法測(cè)定混合藻液細(xì)胞密度波長(zhǎng)的選擇波長(zhǎng)的選擇是可見分光光度法測(cè)量過程中最關(guān)鍵的因素。以往的研究中，因藻種不同使用的波長(zhǎng)存在較大差異，即便是同一藻種也不盡相同。例如，周利等研究偽魚腥藻的生長(zhǎng)采用的是665nm可見光;而李麒龍等研究二形柵藻生長(zhǎng)采用680nm。在對(duì)小球藻的研究過程中，學(xué)者們分別采用540、570和680nm的可見光。對(duì)一些綠藻吸收光譜的掃描研究結(jié)果表明，藻類吸收峰可分為3個(gè)區(qū)，其研究顯示，200～400nm紫外光區(qū)的吸收峰主要是藻體中的蛋白質(zhì)引起;由于藻蛋白含量受藻生長(zhǎng)時(shí)間的影響變化很大，因此一般不宜采用該波長(zhǎng)對(duì)藻類生物量進(jìn)行定量測(cè)量。而在＞400～ 600nm藍(lán)光區(qū)，葉綠素、類胡蘿卜素等色素則出現(xiàn)明顯的吸收峰，且各色素吸收峰相距較近，容易相互干擾或常表現(xiàn)交疊。因藻類都含有葉綠素a，所以其吸收光譜具有明顯的相似性，葉綠素a在670～680nm的紅光區(qū)吸收峰最為顯著。該研究結(jié)果也顯示，二形四鏈藻在藍(lán)光區(qū)域沒有明顯的吸收峰，但在680nm左右與偽魚腥藻一樣，均有一個(gè)明顯的吸收峰，這一結(jié)果與上述研究結(jié)論非常相近。此外，趙巧華等認(rèn)為同一藻的標(biāo)準(zhǔn)化吸收光譜在不同生長(zhǎng)時(shí)期基本恒定不變，色素組成及其比例的不同是引起藻類間吸收光譜變化的主要原因;涂波等對(duì)6株4屬綠藻的研究表明，形態(tài)上的巨大差異、不同生長(zhǎng)時(shí)間、不同生理狀態(tài)并不影響它們?cè)?span>685nm處都具有最大吸收峰的特征，685nm處的OD值能準(zhǔn)確反映微小綠藻生物量的變化;對(duì)于單一藻種，雖然在其他波長(zhǎng)測(cè)定藻細(xì)胞密度也能獲得極顯著的線性相關(guān)，該研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，但是為了便于種類間比較以及應(yīng)用的普遍性，選用吸收峰680nm最為適宜。

3.2可見分光光度法測(cè)定混合藻液生物量的準(zhǔn)確性可見分光光度法測(cè)定藻細(xì)胞密度多見于室內(nèi)單種研究。在自然水體采集的藻類樣本，常常門類眾多，這使得研究單一藻種光吸收與藻細(xì)胞密度之間關(guān)系存在明顯的局限性。而采用可見分光光度法測(cè)定混合藻液細(xì)胞密度與光吸收之間關(guān)系的研究還很少見。涂波等用6株綠藻培養(yǎng)到20d，按等體積比例將6種藻液混合，設(shè)置不同梯度濃度，在685nm可見光測(cè)定OD值，分析其與混合藻液藻細(xì)胞密度之間關(guān)系，結(jié)果顯示，OD685與總細(xì)胞密度存在顯著的線性相關(guān);這一研究結(jié)果表明，在685nm可見光下，藻液的OD值可以有效反映混合藻液的細(xì)胞密度，且精確度及穩(wěn)定性均高于常規(guī)顯微計(jì)數(shù)。在該研究中，將二形四鏈藻與偽魚腥藻混合后，測(cè)定混合藻液在680nm處的OD值，發(fā)現(xiàn)其與總藻密度之間也存在顯著的線性相關(guān)。由此可見，可見分光光度法能夠有效反映吸光度與不同門類混合藻液細(xì)胞密度之間的線性相關(guān)。

在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，藻密度和葉綠素a之間的關(guān)系研究多僅限于純?cè)宸N之間，如銅綠微囊藻等。該研究結(jié)果顯示，單種或混合藻種在680nm處的吸光度與藻密度、藻密度與葉綠素a之間均具有顯著的線性相關(guān)性，證明可見分光光度法可用于藍(lán)藻偽魚腥藻與綠藻混合藻樣生物量的測(cè)定研究。這無疑為重要自然水體中特別在水華初期尚未形成絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群時(shí)快速檢測(cè)浮游植物的生物量提供有效方法，從而為水華初級(jí)階段的有效預(yù)警提供了重要技術(shù)支撐。然而，并不是所有微藻的細(xì)胞密度與吸光度之間均呈顯著的線性相關(guān)，沈萍萍等選用綠藻門、金藻門、黃藻門、甲藻門在內(nèi)的15種不同微藻，經(jīng)回歸分析表明，形狀越規(guī)則的細(xì)胞，藻液的吸光度與細(xì)胞密度之間的線性相關(guān)性越好;而甲藻類細(xì)胞形狀多樣，且細(xì)胞體積較大，其相關(guān)性明顯較差。相關(guān)研究同時(shí)顯示，因藻細(xì)胞形態(tài)和在計(jì)數(shù)框線位置的原因，在鏡檢條件下進(jìn)入觀察視野框線的藻細(xì)胞經(jīng)常不被計(jì)入統(tǒng)計(jì);因此，采用顯微計(jì)數(shù)制定藻密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，在統(tǒng)計(jì)過程中會(huì)出現(xiàn)與真實(shí)數(shù)據(jù)間有顯著誤差的情況。這一研究結(jié)果提示，在使用可見分光光度法測(cè)定藻細(xì)胞生物量實(shí)踐中，要特別關(guān)注樣品中哪些藻種細(xì)胞形態(tài)與大小對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

3.3可見分光光度法測(cè)定混合藻液生物量的應(yīng)用展望近年來，有關(guān)碳生物量與吸光系數(shù)之間關(guān)系已經(jīng)逐步開展。沈萍萍等通過藻體積計(jì)算出其碳生物量，并將碳生物量與吸光系數(shù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示，只要測(cè)得單一藻液或者混合藻液的吸光系數(shù)，就可以通過回歸方程求得它們的碳生物量，從而大大簡(jiǎn)化浮游植物作為碳積累和排放重要載體過程中生物量的測(cè)定過程與方法?？梢姺止夤舛确y(cè)定浮游植物生物量，能夠同步測(cè)定藻密度、葉綠素a濃度和碳生物量及其相互轉(zhuǎn)換。此外，駱巧琦等通過幾種餌料藻種的室內(nèi)試驗(yàn)，研究表明基于可見分光光度法導(dǎo)數(shù)數(shù)學(xué)模型可不受藻類所處生長(zhǎng)周期的影響;其算法簡(jiǎn)單快速、精確度高，非常適宜微藻進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期和衰退期的評(píng)估和判斷。結(jié)合該研究結(jié)果初步表明，可見分光光度法測(cè)定不同門類混合藻液樣品的生物量具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為相關(guān)理論和方法的進(jìn)一步研究提供了重要的應(yīng)用價(jià)值依據(jù)?？梢姺止夤舛确▋x器要求低、方法簡(jiǎn)便和相對(duì)準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，對(duì)基層環(huán)保單位和養(yǎng)殖戶具有重要應(yīng)用價(jià)值，但目前分光光度法應(yīng)用于自然水體混合藻液生物量的研究?jī)H限于個(gè)別報(bào)道，仍需要進(jìn)一步深入研究。

文章來源：[1]曾祥波,李丁恒.可見分光光度法測(cè)定偽魚腥藻與二形四鏈藻混合藻液生物量[J/OL].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),1-4[2025-04-16].http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1076.S.20250228.1517.018.html.