測定血清中21種元素的前處理方法研究

目的:采用電感耦合等離子體質譜技術，測定血清中21種元素含量，重點優(yōu)化血清中多元素測定的樣品前處理方法。

方法:采用1%硝酸，1% TtitonX-100，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸銨與1%乙醇混合溶劑稀釋血清樣品20倍后，進入ICP-MS 儀器檢測 Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo、Sb、Fe、Cu、Zn、Se、Al、As、Sr、Pb、Sn 和 Cr 21 種元素的含量。

結果:血清中21種元素在線性范圍內線性良好（r＞0.995）；檢出限為0.14～15.90μg/L。方法用于孕婦血清樣本檢測，低高濃度2個水平的血清加標回收率為82.2%～121.5%，相對標準偏差小于10%。采集639名孕婦血清樣本進行檢測，21種元素中除Tl、W、La、Ce、Hg，其余元素均有檢出。

結論:通過條件優(yōu)化，采用混合溶劑稀釋法聯(lián)合ICP-MS對血清中21種金屬元素分析，方法快速、簡便、準確，適宜用于評估人體元素暴露水平。

目前發(fā)現(xiàn)的金屬元素有80余種，人體中含有60余種，其中占人體總質量0.01%的微量元素有20余種如鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、鎳、鉬、錫等，雖然在人體內的含量較低，但它們是構成細胞結構必不可少的成分，在人體代謝和生理過程中發(fā)揮著重要作用；還有一些重金屬元素不是生命活動所必須，且超過一定濃度都對人體有毒如鎘、鉛、砷、汞等。人體可通過食品、飲水、空氣等攝入元素，為了準確高效的監(jiān)測人體元素暴露水平，評估其健康效應，建立血清中多元素同時分析方法是必要的。

雖然目前多元素檢測的方法已較成熟，在常用的原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法和電感耦合等離子體質譜法（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）中，ICP-MS法的寬線性范 圍、高靈敏度和強抗干擾能力，使其在多元素分析中具有不可比擬的優(yōu)勢，應用范圍越來越廣，尤其在生物樣品檢測中，ICP炬焰的超高溫，使得樣品經(jīng)簡單處理也能獲得滿意的效果。不同的元素在體內的存在形態(tài)不同，溶出所需條件亦有差異，雖已有 ICP-MS 測定血清元素的諸多報道，但筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)，樣品前處理的不同會帶來極大的影響，要兼顧各元素分析，獲得靈敏準確的結果尚屬不易。因此本文通過重點優(yōu)化血清樣品前處理條件，選擇21種常見金屬元素進行ICP-MS分析，構建出一種快速、準確的檢測方式，并用于孕婦血清樣品的批量分析。

材料與方法

材料: 樣品來源于臨床檢驗樣品，血樣采集后進行血清分離，將血清分裝并放入凍存盒中，于－80 ℃冰箱保存。

儀器: 電感耦合等離子體質譜儀(上海美析儀器有限公司)

標準品和試劑：購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心的21種待測元素標準溶液⁵⁵ Mn、⁵⁹ Co、⁶⁰ Ni、¹¹¹ Cd、¹³⁹ La、¹⁴⁰ Ce、¹⁸² W、²⁰¹ Hg、²⁰⁴ Tl、⁹⁶ Mo、¹²² Sb、⁵⁶ Fe、⁶⁴ Cu、⁶⁶ Zn、⁷⁸ Se、²⁷ Al、⁷⁵ As、⁸⁸ Sr、²⁰⁸ Pb、¹¹⁸ Sn和⁵² Cr，濃度1000 μg/mL。

5種內標元素標準溶液：⁴⁵ Sc、⁷² Ge、¹¹⁵ In、¹⁵⁹ Tb和²⁰⁹ Bi，自國家有色金屬及電子材料分析測試中心購入，濃度為1000 μg/mL。

硝酸（BV-III 級），購自北京化學試劑研究所。Triton X-100（LR級），購自Sigma-Aldrich公司。乙醇和四甲基氫氧化銨均為分析純。

實驗方法

ICP-MS儀器條件：通過自動調諧和優(yōu)化，確定ICP-MS條件為：射頻功率1550W，載氣流速 1.05 L/min，采樣深度 8.0 mm，霧化器泵速 0.10 rps， 霧化室溫度2 ℃，提取透鏡－200.0 V；四級桿偏轉電壓－3.0 V；八級桿射頻功率150 V，能量歧視5.0 V。 各元素均選擇He模式進行測定，八級桿碰撞池He 氣流速1.0 L/min。

樣品稀釋劑配制：實驗采用1%硝酸（BV Ⅲ級）溶液，1%TtitonX-100 溶液，0.01%吡咯烷二硫 代氨基甲酸銨與 1%乙醇混合作為樣品稀釋劑。 具體配制方法：以配制 1000mL稀釋劑為例，加入硝酸 10 mL，曲拉通 X-100 0.5g，吡咯烷二硫代氨 基甲酸銨 0.10 g，乙醇10mL，用純水溶解并定容至1000mL，充分混勻后置4 ℃保存。

標準溶液配制和標準曲線制定 參考21種元素在血清中的濃度，分為3個濃度系列配制標準應用液，其中Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和Sb為同一系列濃度，元素應用液濃度為40μg/L； As、Sr、Pb、Sn、Cr為同一系列濃度，元素應用液濃度為100 μg/L；Fe、Cu、Zn、Se和Al為同一系列濃度，元素應用液濃度為1000μg/L。分別吸取混合標準應用液0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL，定容至10 mL，配制成標準系列濃度：Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和 Sb 標準系列濃度為 0 μg/L、0.20 μg/L、0.40 μg/L、0.80 μg/L、2.00 μg/L、4.00 μg/L；As、Sr、Pb、Sn和Cr標準系列濃度為0 μg/L、0.50 μg/L、1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L；Fe、Cu、Zn、Se 和 Al 標 準 系 列 濃 度 為 0 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L、20.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00 μg/L。

將上述標準系列溶液注入 ICP-MS 中進行分 析，以各待測元素濃度為橫坐標，各待測元素與相應內標元素的響應值比值為縱坐標，繪制標準曲線。選擇與待測元素原子量接近的內標進行相應的校正。

方法學驗證 從靈敏度（檢出限）、精密度（相 對標準偏差）和準確度（回收率）3方面進行方法學驗證，以考察方法性能，數(shù)據(jù)分析通過 Excel 2007進行計算。通過平行測定混合血清10次，以測定值的3倍和10倍標準差對應的濃度計算檢出限 （LODs）和定量限（LOQs）；吸取混合血清樣品9份， 其中3份用于測定本底值，另取6份分別加入定量限和 2 倍定量限水平的標準溶液，在1日內重復測 定6次和6日內重復測定21種元素的含量，計算測得值的相對標準偏差值（RSDs）和加標回收率。

樣品分析 采集血樣后分離血清，將血清分裝于0.5mL離心管內，編號并放入凍存盒內，－80 ℃冰箱保存。實驗前取出于室溫下解凍。吸取100μL血清樣品于5mL塑料離心管中，加入稀釋劑：1%硝酸 （BV Ⅲ級）溶液，1%TtitonX-100溶液，0.01%吡咯烷 二硫代氨基甲酸銨與1%乙醇直接稀釋20倍，渦旋混勻，10 000 r/min離心2 min，取上清進樣分析。質控血清以同樣方式進行處理。

樣品分析的質量控制 每批次上機前和每測30個樣品后進行質控檢測，包括程序空白、平行樣和質控樣品。程序空白實驗是指前處理過程中，除不加樣品外，其他步驟同1.3樣品分析，用于監(jiān)測整個實驗分析階段中待測元素的干擾，若在進樣液中檢出待測元素，則需排除原因后重新測定。平行樣指對同一血樣進行相同的處理和分析，2次檢測結果差值應不超過平均值的10%，否則需排除原因后重新分析。ClinChek微量元素質控樣檢測，測得值與標準值的相對偏差均在參考值范圍內。

ICP-MS 測定模式選擇 采用碰撞反應模式（He）和標準模式（No gas）考察了ICP-MS的測定模式，通過加標樣品分析，各元素在He模式下的回收率均優(yōu)于No gas 模式，回收率在80%～120%范圍內。因此實驗選擇在He模式下進行測定。

樣品前處理方式優(yōu)化

直接稀釋法與微波消解法的比較 ICP-MS測定時常用的樣品前處理方式有微波消解法和直接稀釋法。消解法對有機物的消解能力強，能更有效降低樣品的基質效應，但操作相對繁瑣，消解過程中待測元素易受到污染和損失。ICP-MS采用超高溫的ICP炬焰，對物質進行離子化的同時，也可使樣品基質高溫下徹底灰化，因此一些液態(tài)樣品經(jīng)過簡單的處理如稀釋、過濾等，即可引入儀器進行元素測定。實驗比較了直接稀釋法和微波消解法的加標樣品回收率，結果表明采用消解法，Al、Pb等元素空白值偏高（＞2.0 μg/L）且相對標準偏差大（15%～30%），并且由于加熱趕酸會造成Hg元素損失，回收率偏低（低于70%）；直接稀釋法的元素回收率均較為理想（高于80%），空白可以得到有效控制。因此，實驗選擇直接稀釋法進行樣品處理，并進一步優(yōu)化了稀釋劑組合和稀釋倍數(shù)。

稀釋劑選擇 稀釋溶劑一般使用水和一定濃度的硝酸，為了提高測定靈敏度，可加入非離子性表面活性劑或有機試劑如曲拉通X-100、乙醇，以及金屬絡合劑如吡咯烷二硫代氨基甲酸銨，同時防止未溶解的生物蛋白物質堵塞 ICP-MS 霧化系統(tǒng)。與酸性稀釋劑相比，堿性稀釋劑如四甲基氫氧化銨，可減少酸度對ICP-MS的干擾，又可以快速消除記憶效應。綜上，參考美國疾病預防控制中心測定標準（DLS 3016.8. Blood Metals Panel 2 （BMP2）ICP-DRC-MS.）和中國團體標準（T/WSJD 19.1—2021，全血中 23 種元素的電感耦合等離子體質譜法），實驗擬采用 1%硝酸溶液、0.05%Triton-100、0.01%吡咯烷二硫代氨基甲酸銨、1.0%，v/v 四甲基氫氧化銨、1%乙醇作為稀釋溶劑，并采取以下4 種組合方式進行實驗，選取最優(yōu)稀釋劑組合。方法①：四甲基氫氧化銨（1.0%，v/v）＋曲拉通 X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）；方法②：曲拉通X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）（色譜純?yōu)榧眩跛幔?.0%，v/v）；方法③：曲拉通 X100（0.05%）＋硝酸（1.0%，v/v）＋吡咯烷二硫代氨基 甲酸銨（0.01%）；方法④：曲拉通X-100（0.05%）＋硝 酸（1.0%，v/v）＋乙醇（1%，v/v）。

經(jīng)過幾種組合的比對，實驗結果顯示，硝酸的加入可以顯著提高 Al、Ni 2 種元素的線性，以及Cu、Sn、La、Ce 的回收率（從＜60%增至＞75%），說明這幾種元素在硝酸介質中不易降解或沉淀損失，更易溶出；吡咯烷二硫代氨基甲酸銨加入可以顯著提高Sn、La、Ce的回收率（從＜40%增至＞88%），說明吡咯烷二硫代氨基甲酸銨可提高這幾種元素的溶出；乙醇的加入可使得As的回收率好轉，且能有效提高大多元素的響應值（1.1～1.5 倍）；四甲基氫氧化銨的添加會造成 Al、Cu、La、Ce 等元素回收率下降，可能是堿性條件下容易發(fā)生沉淀造成損失，對其余各元素影響甚小。綜合各元素回收率的情況，實驗最終選取稀釋劑組合為：1%硝酸，0.05%TrtionX-100 溶液，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸銨，1%乙醇。

稀釋倍數(shù) 隨機抽取10份血清樣品混合，優(yōu)化的稀釋劑，在10～30倍范圍內對稀釋倍數(shù)進行了考察。由于血清粘度較大、基質較復雜，采用較低稀釋倍數(shù)時，容易堵塞進樣毛細管，對部分元素尤其是樣品中低含量的元素分析產(chǎn)生干擾，使其測定的精密（＞20%）和回收率較低（40%～60%），但稀釋倍數(shù)太高又會導致一些元素分析靈敏度低。綜合考慮回收率和靈敏度，實驗最終選擇血 清樣品稀釋20倍，離心后進樣分析。

討論

檢測模式和樣品前處理方式 實驗比較了 ICP-MS 在 2 種模式下（He模式/No Gas 模式）各種元素的測定結果，考慮到元素的線性回歸以及加標回收率，在前者模式下各種元素有更好的結果呈現(xiàn)， 因此實驗選擇了在He模式下進行元素測定。這基于He模式可以有效消除多原子離子干擾，是ICP-MS測定的基本原理，在此不再贅述。 實驗重點考察了血清樣品前處理方式，采用消解法與直接稀釋法對血清樣品進行前處理。與文獻報道一致，消解法可以徹底的除去血清中的有機基質，取得良好的回收率，但揮發(fā)性元素的揮發(fā)損失、消解后的趕酸過程以及因趕酸不徹底帶來的酸度干擾，均會使操作更為繁瑣或降低方法的準確度。

儀器參數(shù)

ICP-MS6880電感耦合等離子體質譜儀

1.產(chǎn)品介紹
電感耦合等離子體質譜儀 (簡稱ICP-MS），是20世紀80年代發(fā)展起來的一種新的微量、痕量和超痕量元素分析技術。ICP-MS可測定元素周期表中大部分元素，且具有極低的檢出限、極寬的動態(tài)線性范圍、譜線簡單、干擾少、精密度高、分析速度快等性能優(yōu)勢。
2.性能特點
◇ 集成氣路模塊，減少氣路接頭，輕量化、模塊化，保障儀器便于移動工作
◇自主研發(fā)的固態(tài)電源可以保證儀器在多種模式（如常規(guī)模式、冷等離子體模式）下運行，并且在同一方法中允許運行多種模式，節(jié)約大量分析時間及方便研究。
◇ 采用主流化市場設計，為用戶特別是第三方檢測用戶大大節(jié)省了儀器占用空間，也為未來實現(xiàn)車載應用，增加了可能性。
◇中英文快速切換軟件界面，“一鍵式”參數(shù)設置直觀快捷，提高了用戶的工作效率，也提供自動控制儀器及其附件的能力，丸渼適應Windows 專業(yè)操作系統(tǒng)
3.應用領域
高校、質檢中心、環(huán)境監(jiān)測站、企業(yè)、農(nóng)業(yè)系統(tǒng)、地質地礦、 環(huán)境保護、地質冶金、電子電器、食品安全、化工制藥等。

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上海美析儀器有限公司(以下簡稱美析)，是一家具有自主知識產(chǎn)權的高新技術企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測試儀器領域，不斷開發(fā)出先進的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質儀器資源的供應者。

美析主營光譜類儀器可見分光光度計、紫外可見分光光度計、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計、原子熒光光度計、ICP 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、ICP 電感耦合等離子體質譜儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應用于有機化學、無機化學、生物化學、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領域。同時美析利用在產(chǎn)品機械結構、光學設計、電氣應用和軟件開發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗，結合市場的需求，近期將陸續(xù)推出一批分析類儀器。美析的總部及生產(chǎn)基地設在上海，營銷中心設在北京，并在江蘇、上海、山東三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源，美析與國內外的部分科研單位也進行了深層次的科研合作，不斷將科研成果轉化為生產(chǎn)力。為更好的服務于廣大客戶，美析儀器國內設有 12家辦事機構，度身定制符合您需求的應用解決方案，提高產(chǎn)品的附加值。在不斷服務國內用戶的同時，美析也與 20 多個國家的分銷機構建立了深度的戰(zhàn)略合作關系。

及國內多項資質審查認證，并有著多項自行研發(fā)的光譜類專利版權等等）