保元湯中總多糖、總黃酮、總皂苷三大類成分的含量測定
引言
《簡明醫(yī)彀》中的保元湯由五味藥組成：人參、黃芪、甘草、肉桂、生姜5味藥組成。“人參一錢，黃芪二錢，甘草五分，肉桂二分，右加生姜一片，水煎服”，其主治“元氣虛弱，精神倦怠，肌肉柔慢，飲食少進，面青白...及有雜證”。該方沿用至今，歷史悠久，傳統(tǒng)治療虛損勞怯、元氣不足[4]。現(xiàn)代研究明確保元湯具有保護肝腑臟器、調(diào)節(jié)免疫功能、抗疲勞、抗氧化、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等作用，臨床應(yīng)用于慢性心力衰竭以及氣血不足等慢性虛弱癥的治療。本課題的研究以功效為導向選擇指標成分，建立保元湯物質(zhì)基準中大類成分(總多糖、總黃酮、總皂苷)含量測定分析方法，為保元湯物質(zhì)基準的質(zhì)量研究提供分析方法基礎(chǔ)。
1材料
1.1藥材
1.2儀器
分析天平
1.3試劑
2方法
2.1保元湯制備
制備流程為：人參7.5g、黃芪14.9g、甘草3.72g、肉桂1.5g、生姜2g，以10倍水浸泡30min，武火至沸騰，文火煎煮40min，煎液以雙層紗布趁熱過濾。60℃水浴，減壓濃縮至150mL即得。
2.2凍干粉制備
經(jīng)課題組前期研究，將標準煎液在-80℃預凍5h，冷凍干燥72h即得凍干粉。
2.3總多糖含量測定方法的建立
2.3.1供試品溶液制備
精密量取標準湯劑15mL(或凍干粉500mg，以15mL純化水溶解)，加入乙醇離心吹干后以5.0mL水溶解，凍干后得粗多糖。精密稱取粗多糖5.0mg，以純化水溶解定容至25mL，即得。
2.3.2試劑用量考察
2.3.2.1醇沉倍數(shù)
稱取凍干粉500mg，以15mL水溶解，考察2、4、6、8、10、12倍的醇沉條件對多糖含量影響。
2.3.2.2苯酚濃度
苯酚硫酸法檢測得不同苯酚濃度反應(yīng)下的樣品波長掃描圖。
2.3.2.3硫酸用量
在確定苯酚的濃度的情況下，改變濃硫酸用量(0mL、3mL、5mL、7mL、9mL)，檢測得掃描圖。
2.3.3方法學驗證
2.3.3.1線性與范圍
精密吸取對照品溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，苯酚硫酸法分別重復測定3次吸光度，繪制標準曲線。
2.3.3.2精密度試驗
制備供試品溶液，在最大吸收波長處讀取吸光度，重復6次，計算RSD值。
2.3.3.3重復性試驗
平行制備6份供試品溶液，在最大吸收波長處讀取吸光度，每份重復測定3次，計算RSD值。
2.3.3.4穩(wěn)定性試驗
制備供試品溶液，在24h內(nèi)按1、2、4、6、8、10、20、24h在最大波長處測定吸光度，重復3次測定，并計算其RSD值。
2.3.3.5加樣回收率試驗
向已知被測成分含量的供試品，按1∶1的比例加入D無水葡萄糖，平行制備6份，按照以下公式計算加樣回收率。
2.3.3.6驗證試驗
照2.3.1制備供試品溶液，反應(yīng)時精密移取供試品溶液1.0mL，照本節(jié)“2.3.3.1”的線性與范圍項下方法，計算D-葡萄糖的量。
2.4總黃酮含量測定方法的建立
2.4.1對照品的選擇
制備每1mL含0.8mg的三種對照品溶液與鋁鹽反應(yīng)后，選擇最佳的總黃酮含量的對照品。
2.4.2樣品前處理考察
精密量取標準湯劑15mL，考察過固相萃取柱、標準煎液直接稀釋在進行亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法后，進行全波長掃描。
2.4.3方法學驗證
2.4.3.1線性與范圍
精密吸取對照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，補至0.5mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，加10%硝酸鋁溶液1mL，加4%氫氧化鈉試液10mL，重復測定3次吸光度。
2.4.3.2精密度試驗
按照以上確定的條件方法制備供試品溶液，測定吸光度，重復6次，計算RSD值。
2.4.3.3重復性試驗
平行制備6份供試品溶液，測定吸光度，重復3次，計算RSD值。
2.4.3.4穩(wěn)定性試驗
制備供試品溶液，在24h內(nèi)按0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h的時間點，測定吸光度，重復3次，計算RSD值。
2.4.3.5加樣回收率試驗
取已知濃度樣品，按質(zhì)量1：1的比例分別加入甘草苷對照品適量，按以上條件進行反應(yīng)，平行制備6份，按照2.3.3.5公式計算加樣回收率。
2.4.3.6驗證試驗
照2.3.1制備粗多糖，過固相萃取柱，以10.0mL的水和甲醇洗脫，收集洗脫液，甲醇定容至100mL，得供試品溶液，反應(yīng)時取0.5mL，照本節(jié)繪制標準曲線方法，計算甘草苷的量。
2.5總皂苷含量測定方法的建立
2.5.1樣品前處理考察
對照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷Re對照品5mg，以甲醇溶解并定容至50mL。
供試品溶液的制備：照2.3.1制備供試品溶液，考察以10倍乙醇醇沉后取上清液和過固相萃取柱的兩種前處理方法。
2.5.2試劑用量條件考察
硫酸乙醇溶液：取人參皂苷Re200μL，揮去溶劑，加入0.5mL的8%香草醛乙醇試液，分別加入72%、75%、77%的硫酸乙醇溶液5.0mL。
香草醛乙醇溶液：考察6%、8%、10%、12%的香草醛乙醇對試驗結(jié)果的影響。
2.5.3方法學驗證
2.5.3.1線性與范圍
精密吸取人參皂苷Re對照品溶液0μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL，加入8%香草醛乙醇0.5mL和77%硫酸乙醇5mL，60℃反應(yīng)15min后，冰水浴2min，測定吸光度，重復3次。
2.5.3.2精密度試驗
制備供試品溶液測定吸光度，重復6次，并計算RSD值。
2.5.3.3重復性試驗
同批次樣品平行制備6份供試品溶液，測定吸光度，重復3次，并計算RSD值。
2.5.3.4穩(wěn)定性試驗
在10h內(nèi)按0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h的時間點，讀取吸光度，重復3次，計算吸光度RSD值。
2.5.3.5加樣回收率試驗
取已知濃度的供試品，按1∶1的比例加入人參皂苷Re，平行制備6份，按照2.3.3.5公式分別計算加樣回收率。
2.5.3.6驗證試驗
照2.3.1制備供試品溶液，平行制備3份。精密吸取200μL，按照本節(jié)中繪制標準曲線的方法，測定吸光度，測定3次計算人參皂苷Re的量。
討論
天然植物類藥物中多存在多糖類物質(zhì)，其特性可用于計算總多糖的含量。人參中多含有不易溶性的多糖成分，采用醇沉揮干有機試劑后立即以純化水復溶，以凍干形成凍干粉的均勻狀態(tài)進行總多糖的測定，以實現(xiàn)測定方法的準確性。
黃酮類化合物存在于大多植物中，檢測黃酮類的文獻中多以蘆丁為對照品，但由于保元湯中的黃酮類與蘆丁在化學結(jié)構(gòu)上的形成共軛結(jié)構(gòu)，導致在相同的反應(yīng)中呈現(xiàn)不同的顏色以及最大吸收波長，故依據(jù)黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，選擇最佳的對照品以及前處理方法以滿足總黃酮含量測定的準確性。
皂苷類物質(zhì)廣泛分布于植物界中，保元湯中的皂苷類物質(zhì)來源于人參、黃芪和甘草。無水條件下，三萜皂苷類物質(zhì)在強酸環(huán)境中發(fā)生反應(yīng)形成發(fā)色基團后顯色，由此可根據(jù)最大吸收波長進行定量測定。
文章來源：[1]張壯,王志強,鄒妍,等.保元湯中總多糖、總黃酮、總皂苷三大類成分的含量測定[J].廣東化工,2025,52(02):132-137.
