民族藥銳貓棍多糖及總糖含量測定

        苗藥銳貓棍，即有柄石韋，貴州水質(zhì)偏硬的多民族地區(qū)，泌尿系統(tǒng)中的結(jié)石病較為常見，而銳貓棍（有柄石韋）常被用來治療該疾病，是貴州民間常用民族藥物。有柄石韋在《神農(nóng)本草經(jīng)》一書中被記載具有多種藥用功效，包括利尿通淋、清肺止咳以及涼血止血等?；谶@些傳統(tǒng)用途，市場上出現(xiàn)了許多以有柄石韋為主要成分的中成藥，這些藥品主要用于實(shí)現(xiàn)利尿和通淋的效果，其中包括復(fù)方石韋片、復(fù)方石韋顆粒和復(fù)方石韋膠囊等多種制劑。

有柄石韋富含黃酮類、酚酸類、多糖等化學(xué)成分，但關(guān)于多糖在藥物功效的協(xié)同作用研究文獻(xiàn)較少。課題組前期已對黔產(chǎn)有柄石韋展開了大量化學(xué)成分及藥理作用研究，篩選出了一批具有良好利尿通淋功效的活性化合物，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。但中藥民族藥多為多成分調(diào)節(jié)的結(jié)果，為研究有柄石韋多糖在其利尿通淋的協(xié)作機(jī)制，本課題組擬對其多糖及總糖進(jìn)行研究。

1　儀器與材料

1.1主要儀器

紫外可見分光光度計（上海美析儀器有限公司）；離心機(jī)；電熱鼓風(fēng)干燥箱；分析天平；水浴鍋。

1.2試劑與材料

無水乙醇、石油醚、95％乙醇、正丁醇（分析純ＡＲ，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；5％苯酚、98％濃硫酸（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；蒸餾水、葡萄糖（分析純ＡＲ，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3樣品

銳貓棍

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備

在對無水葡萄糖進(jìn)行105℃干燥至恒重后，精確稱取545.6mg的樣品并將其置入一個1000mL的量瓶中，接著加水進(jìn)行溶解，并稀釋至刻度，充分混勻后即可獲得濃度為545.6mg/L的葡萄糖溶液。接下來，從這一溶液中精確吸取15mL，并定容至25mL，從而制備出濃度為327.36mg/L的對照品溶液。然后，分別吸取0.0mL、0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.2mL、1.5mL和1.8mL的葡萄糖對照品溶液，放置于25mL的比色管中，利用蒸餾水補(bǔ)足至2mL，隨后精確加入3mL的濃硫酸和1mL的5％苯酚溶液，充分混合后放置在沸水中加熱15分鐘。取出后放入冷水中冷卻5分鐘，再次取出并在490ｎm的波長下測量吸收度。通過將吸收度Ａ作為縱坐標(biāo)，濃度Ｃ作為橫坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2供試品溶液制備

有柄石韋的供試樣品首先經(jīng)過風(fēng)干處理，隨后粉碎，再在60℃的環(huán)境下烘干至恒重。接著，取約1.0g的供試樣品進(jìn)行精密稱定，按照“2.3.2”項(xiàng)下的操作步驟進(jìn)行脫脂和色素的提取，以及去除其中的單糖、低聚糖及醇溶性雜質(zhì)。隨后，樣品在100℃的水浴中進(jìn)行三次提取，最后將濾液合并、濃縮，并將體積定容至100mL。最后，精密吸取10mL的濃縮液，并用水稀釋至50mL，從而得到所需的實(shí)驗(yàn)溶液。

2.3多糖的測定

2.3.1半透膜的制備　取10mL火棉膠溶液，緩緩將其倒入150mL的錐形瓶中。在此過程中，小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，使得火棉膠在瓶壁上形成一層厚薄均勻的薄膜。隨后，將多余的火棉膠液體倒回原瓶中。接著，將錐形瓶倒置于鐵架臺的鐵圈上，等待剩余的火棉膠完全流盡。待溶液充分揮發(fā)后，輕輕用手指觸碰火棉膠表面，直至不再感到粘手為止。此時，往錐形瓶中注滿水，浸10min，倒去瓶中的水，然后在瓶口揭開一部分膜，在膜與瓶壁間加入適量的水，使膜與瓶壁分開，輕輕取出薄膜，半透膜灌水懸空，袋中水能逐漸滲出為合格。

2.3.2多糖的提取與精制　取自風(fēng)干的黔產(chǎn)有柄石韋樣品，首先將其粉碎，并在60℃的環(huán)境下烘干至恒重。接著，精確稱取30g的有柄石韋粉末，用紙包好放置于索氏提取器中，經(jīng)過石油醚的回流提取，以去除脂肪及色素，重復(fù)提取兩次，每次持續(xù)3小時。提取后的液體被棄置，藥渣在揮去溶媒后，隨后進(jìn)行80％乙醇的回流提取，同樣進(jìn)行兩次，每次持續(xù)4小時。在再次處理完藥渣后，加入蒸餾水并在100℃的水浴中提取三次，使用250mL、200mL和200mL的水，每次提取時間為2小時。提取后的藥液隨后合并，通過抽濾進(jìn)行濃縮，然后使用Ｓｅｖａgｅ法離心以去除蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)速為3000ｒ/min，從而獲得多糖溶液。接下來的步驟是將該溶液置于半透膜中進(jìn)行24小時的滴水透析，隨后添加無水乙醇以使乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80％。此混合物在4℃的冰箱中靜置24小時。最后，離心處理以獲得多糖沉淀，并用丙酮、氯仿和無水乙醇進(jìn)行兩次洗滌，最后在60℃條件下烘干至恒重，從而得到純化的有柄石韋多糖，存放于干燥器中以備后用。

2.3.3換算因素的測定　精確稱取60℃下干燥至恒重的有柄石韋多糖4.0mg（共6份），將其溶解并定容至50mL。然后，精確量取2mL溶液置于25mL比色管中，依次加入3mL濃硫酸和1mL的5％苯酚溶液，充分混勻后，將比色管置于沸水中加熱15分鐘。隨后取出比色管，放置于冷水中冷卻5分鐘。最后，在490ｎm波長處測定其吸收度。結(jié)果：平均換算因素ｆ＝1.164，ＲＳＤ為0.3％。

2.3.4方法學(xué)考察　精密度試驗(yàn)中，我們精確吸取了2.0mL的黔產(chǎn)有柄石韋供試品溶液，并進(jìn)行了六次快速連續(xù)的吸光度測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示平均吸光度為0.4420，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（ＲＳＤ）為0.95％，這表明儀器在精密度方面表現(xiàn)良好。

在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，我們同樣精確吸取了2.0mL的石韋供試品溶液，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求進(jìn)行了操作。每隔0.5小時測定一次吸光度，共進(jìn)行六次測定。結(jié)果顯示平均吸光度為0.4417，ＲＳＤ為0.64％，這說明儀器具備良好的穩(wěn)定性。

進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)時，我們精密稱取了6份1.0g的黔產(chǎn)有柄石韋樣品粉末，并按照供試品的制備方法制備供試液，遵循標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示平均含量為4.950％，且ＲＳＤ為0.8％，表明具有較好的重復(fù)性。

在回收率試驗(yàn)中，我們稱取了9份0.5g的黔產(chǎn)有柄石韋樣品粉末，經(jīng)石油醚和乙醇提取后，分別按樣品量的80％、100％、120％添加葡萄糖對照品溶液（各3份）。隨后，按照有柄石韋供試品的制備方法制備供試液并進(jìn)行測定。結(jié)果顯示平均回收率為99.40％，ＲＳＤ為0.94％，這表明該方法具有良好的回收率。

2.3.5樣品中多糖的測定　首先，準(zhǔn)確稱取有柄石韋供試品1.0g，共準(zhǔn)備6份樣品。接著，按照既定的供試品溶液制備方法進(jìn)行供試液的制備，隨后進(jìn)行相應(yīng)的測定。

2.4總糖的測定

2.4.1總糖的提取及供試品溶液的制備　選取風(fēng)干的黔產(chǎn)有柄石韋樣品后，將其粉碎，然后在60℃的環(huán)境下進(jìn)行烘干，直到樣品達(dá)到恒重狀態(tài)。接著，精確稱量1.0g的石韋粉末，放入索氏提取器內(nèi)，使用石油醚進(jìn)行回流提取，以去除樣品中的脂質(zhì)和色素，此過程重復(fù)進(jìn)行兩次，每次持續(xù)3小時。在完成提取后，棄去提取液。隨后，將藥渣中的溶劑揮發(fā)掉，在100℃的水浴中，向藥渣中加入50mL的水，進(jìn)行三次提取，提取時間為3小時、2小時和2小時。最后，將所得濾液合并，進(jìn)行濃縮，并調(diào)整體積至100mL。從中取出2mL的母液，再稀釋定容至25mL，即可得到所需的提取液。

2.4.2樣品總糖的測定　精密稱取1.0g有柄石韋樣品（共6份），然后按照預(yù)定的供試品溶液制備方法制備供試液，并進(jìn)行相關(guān)測定。

方法來源：[1]呂振濤,胡春梅,楊武德.民族藥銳貓棍多糖及總糖含量測定[J].微量元素與健康研究,2024,41(06):62-64.