多條件在線光度法測(cè)定桑葚色素穩(wěn)定性
關(guān)鍵詞 分光光度法；在線測(cè)量；實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)；桑葚色素；穩(wěn)定性；美析集團(tuán)（www.antak.com.cn）
天然色素具有安全性高、營(yíng)養(yǎng)豐富、色調(diào)自然等優(yōu)點(diǎn)，在消費(fèi)市場(chǎng)具有極高的認(rèn)可度，目前已建立多種色素檢測(cè)分析方法。桑葚富含花色苷類化合物，色彩鮮艷，色價(jià)高，以其為原料提取的色素，可廣泛應(yīng)用于高端食品、日用品、化妝品和藥品等領(lǐng)域。近年來的研究表明天然色素具有一定的生理活性，具有巨大的開發(fā)利用潛力。
桑葚成熟期氣溫高，成熟集中、果期短，采摘不便，貯存困難，易造成巨大浪費(fèi)和環(huán)境污染。開展桑葚色素高值化利用研究，拓展利用途徑，提高產(chǎn)品附加值，對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)增收具有重要意義。目前，關(guān)于桑葚色素?zé)岱€(wěn)定性的研究較多，但結(jié)果差異較大。光、包裝材料、氧化劑及添加劑等對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性影響的研究較少，且普遍使用定性描述，因此建立桑葚色素穩(wěn)定性準(zhǔn)確、全面的定量描述極為必要。
目前，天然色素穩(wěn)定性研究中多采用單條件控制、手動(dòng)離散取樣測(cè)定方案，勞動(dòng)強(qiáng)度大，樣品容易受到污染，測(cè)定準(zhǔn)確性較差，不便于考察多種條件如溫度、光照、pH 值、氧化、添加劑等對(duì)穩(wěn)定性的影響。本研究開發(fā)了一種多條件控制在線光度法實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)測(cè)定裝置，基于該裝置采用初始動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定桑葚色素穩(wěn)定性。本研究結(jié)果為桑葚色素開發(fā)利用提供技術(shù)支持，為天然色素穩(wěn)定性研究提供新的測(cè)試方法。
1. 材料與方法
1.1 試劑與材料
甲酸、氫氧化鈉、乙酸、三水乙酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過氧化氫、維生素 C（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
桑葚由寧波鄞州中銘農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，成熟果實(shí)，外觀呈紫黑色。
1.2 設(shè)備與儀器
UV-1800 型紫外-可見分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司；
冷凍干燥機(jī)；
恒溫循環(huán)器；
低溫恒溫槽；
pH 計(jì)；
磁力攪拌器；
蠕動(dòng)泵；
5 W 紫外燈（主波長(zhǎng) 254 nm）；
日光模擬燈（標(biāo)識(shí)功率 300 W，其中波長(zhǎng) 315~400 nm 的輻射功率 13.6 W，波長(zhǎng) 280~315 nm 的輻射功率 3.0 W）；
400 μL 流動(dòng)比色皿；
2 mm 厚石英玻璃、2 mm 厚光學(xué)玻璃、1 mm 厚棕色光學(xué)玻璃；
0.15 mm 厚 PET 平板。
1.3 試驗(yàn)方法
反應(yīng)器有效容積 100 mL，連接管路長(zhǎng)度約 60 cm，連接管內(nèi)徑 1.6 mm，管路及流動(dòng)比色皿體積約 1.6 mL。
桑葚果肉水提液過大孔樹脂，合并色素洗脫液冷凍干燥，所得粉末為桑葚色素混合物，以緩沖溶液配制桑葚色素儲(chǔ)備液。
移取一定量桑葚色素溶液加入反應(yīng)器，設(shè)置控制條件，采集吸光度數(shù)據(jù)，采樣間隔 1 min，總時(shí)長(zhǎng) 5 h。桑葚色素降解反應(yīng)速率常數(shù)較低，5 h 測(cè)定為其初始動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
2. 結(jié)果與分析
2.1多條件在線光度法動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集裝置
如圖 1 所示，裝置主要由 7 部分組成。反應(yīng)器為具有色素溶液流入流出接口的夾層燒杯，夾層通入恒溫循環(huán)水保持體系溫度穩(wěn)定。反應(yīng)器下方設(shè)置有磁力攪拌器，上方設(shè)置有光線阻隔材料平板，平板上方為外置光源，反應(yīng)器內(nèi)筒中色素溶液在蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)下流經(jīng)流動(dòng)比色皿-分光光度計(jì)檢測(cè)器測(cè)定后流回循環(huán)。
裝置管道及比色皿存在一定“死體積”，對(duì)反應(yīng)器內(nèi)樣品施加實(shí)時(shí)“非全體性”影響時(shí)（如光照），理論上存在微小延遲，通過延遲動(dòng)力學(xué)方程可予以消除， -dc / d(t - τ) = kAm ，τ 為“死體積”對(duì)應(yīng)延遲時(shí)間（h）。當(dāng)反應(yīng)速率常數(shù)較低、“死體積”遠(yuǎn)小于反應(yīng)器容積、蠕動(dòng)泵快速循環(huán)時(shí)，流動(dòng)比色皿內(nèi)溶液和反應(yīng)器內(nèi)溶液視為等效。
試驗(yàn)裝置適用于慢速液體均相動(dòng)力學(xué)過程初始、全程實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)自動(dòng)在線采集。測(cè)定天然色素褪色動(dòng)力學(xué)時(shí)，向反應(yīng)器內(nèi)加入色素溶液，設(shè)置循環(huán)水溫度、pH 值、外置光源、光線阻隔材料平板、添加物種類和濃度等一種或多種條件組合，開啟攪拌和蠕動(dòng)泵，分光光度計(jì)設(shè)置為動(dòng)力學(xué)模式，檢測(cè)波長(zhǎng)為色素溶液最大吸收波長(zhǎng)，設(shè)置采樣間隔，采集數(shù)據(jù)。溫度 20 ℃ ， 以去離子水為參比， 在反應(yīng)器內(nèi)加入去離子水循環(huán) 1 h ， 吸光度最大差值ΔAmax=0.0021，表明試驗(yàn)裝置及測(cè)量系統(tǒng)噪音極低，具有良好的穩(wěn)定性。
2.2 桑葚色素酸堿穩(wěn)定性
桑葚色素用 pH 值為 3，4，5，6，7，8 的緩沖溶液稀釋，在波長(zhǎng) 400~800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描， 結(jié)果如圖 2 所示，溶液顏色如插圖所示，pH 值對(duì)桑葚色素顏色影響明顯。pH 值為 3 時(shí)溶液中桑葚色素呈現(xiàn)純正紅色，鮮艷濃厚，適用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品調(diào)色，是桑葚色素最佳酸堿環(huán)境，最大吸收波長(zhǎng) 514 nm。pH 值從 3 增大為 8 時(shí)，對(duì)應(yīng)最大吸收波長(zhǎng)紅移，紅色變淺并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色、紅棕色，顏色劣化，感官評(píng)價(jià)變差。
pH 值為 3 時(shí)，以吸光度 A0=0.968 的桑葚色素溶液為儲(chǔ)備液，分別移取 0.05，0.1，0.2，0.4， 0.6，0.8 份儲(chǔ)備液稀釋到 1 份，吸收光譜無變化，稀釋曲線線性良好，如圖 3 所示。色素降解過程中在波長(zhǎng) 514 nm 處監(jiān)測(cè)吸光度的變化。
2.3 桑葚色素?zé)岱€(wěn)定性
在室內(nèi)自然光照，pH 值為 3，反應(yīng)體系溫度分別為 20~80 ℃，吸光度變化如圖 4a 所示。由圖 4a可知，20~50 ℃吸光度下降緩慢，20 ℃時(shí)桑葚色素吸光度 5 h 僅降低 0.004，主要為系統(tǒng)噪音貢獻(xiàn)，60℃開始吸光度降速增加，并隨溫度升高加劇。對(duì)圖 4a 吸光度變化進(jìn)行一次動(dòng)力學(xué)擬合，結(jié)果如圖4b 所示，擬合反應(yīng)速率常數(shù)及相關(guān)系數(shù)見圖 4a 插表，20 ℃時(shí)吸光度變化過小，因噪音掩蓋失真， 相關(guān)系數(shù)低，僅作為參考。30 ℃反應(yīng)速率常數(shù) k30℃=0.0023 h-1，半衰期 τ30℃=301.4 h，80 ℃反應(yīng)速率常數(shù) k80℃=0.0492 h-1，半衰期 τ80℃=14.1 h，表明桑葚色素對(duì)溫度敏感，20 ℃及以下溫度冷藏能長(zhǎng)期保持顏色穩(wěn)定，溫度過高會(huì)加速花色苷破壞。
對(duì)不同溫度反應(yīng)速率常數(shù)按照阿倫尼烏斯方程 ln(k)=lnA-Ea/(RT)擬合，如圖 4b 插圖所示，表觀活化能 Ea=60.2 kJ/mol，較大的活化能表明桑葚色素降解較為緩慢。溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響體現(xiàn)在 2 方面：一方面溫度會(huì)影響氧化、還原、光解過程反應(yīng)速率常數(shù)，另一方面升高溫度使花色苷分子自身熱分解更加顯著。因此，溫度對(duì)于色素穩(wěn)定性極為關(guān)鍵，在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸、貨架等環(huán)節(jié)注意保持低溫。
