各種微量元素的測量
發(fā)布日期：2017-12-27 點擊次數(shù)：
1錫----苯芴酮比色法
試樣經(jīng)消化后，在弱酸性溶液中四價錫離子與苯芴酮形成微溶性橙紅色絡(luò)合物，在保護性膠體存在下與標準系列比較定量。
1、酒石酸溶液(100 g/L)： 2、抗壞血酸溶液(10 g/L):臨用時配制。3、動物膠溶液(5 g/L):臨用時配制。
4、酚酞指示液(10 g/L):用乙醇溶解。 5、氨水(1+1)
6、硫酸(1+9): 7、苯芴酮溶液(0.1g/L):稱取0.020 g苯芴酮（1,3,7一三羥基一9一苯基蒽醌)，加少量甲醇及硫酸（1+9）數(shù)滴溶解，以甲醇稀釋至200 mL。
8、錫標準使用液（10.0ppm）：
吸取 1.00mL-5.00mL試樣消化液和同量的試劑空白溶液，分別置于25mL比色管中。
吸取 0, 0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL錫標準使用液(相當(dāng)0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0ug錫)，分別置于25mL比色管中。
于試樣、消化液、試劑空白液及錫標準液中各加0.5 mL酒石酸溶液(100g/L)及1滴酚酞指示液，混勻，各加氨水(1+1)中和至淡紅色，加3 mL硫酸(1+9),1mL動物膠溶液及2.5 mL抗壞血酸溶液，再加水至25mL_，混勻，再各加2 mL苯芴酮溶液，混勻，1小時后測量，用2 cm比色杯以水調(diào)節(jié)零點，用上海美析723N可見分光光度計于波長490 nm處測吸光度，標準各點減去零管吸光值后，繪制標準曲線或計算直線回歸方程，試樣吸光值與曲線比較或代人方程求出含量。
2磷
食物中的有機物經(jīng)酸氧化，使磷在酸性條件下與鉬酸銨結(jié)合生成磷鉬酸銨。此化合物被對苯二酚、亞硫酸鈉還原成藍色化合物——鑰藍。用上海美析723N可見分光光度計在波長660 nm處測定鑰藍的吸收光值。
1、15%硫酸溶液: 2、鑰酸銨溶液:1g/200ml,用15%硫酸溶液稀釋。
3、亞硫酸鈉溶液:20g/100ml,臨時配制，否則可使鑰藍溶液發(fā)生混濁.
4、磷標準使用液（10.0ppm）：
吸取0.625，1.25，2.5，3.75，5，6.25 ml磷標準使用液(相當(dāng)于含磷量0，5,10,20,30,40,50ug)分別置于25mL具塞試管中。
準確吸取試樣測定液2.5mL及同量的空白溶液，分別置于25ml具塞試管中。
依次加人2.5mL鉬酸溶液搖勻，靜置幾秒鐘。加人1.25 ml亞硫酸鈉溶液，1.25 mL對苯二酚溶液，搖勻。加水至刻度，混勻。靜置30分鐘以后，在分光光度計660 nm波長處測定吸光度。以測出的吸光度對磷含量繪制標準曲線。
3鎳
試樣中的鎳用稀酸提取后，在強堿性溶液中以過硫酸銨為氧化劑，鎳與丁二酮杇形成紅褐色絡(luò)合物，與標準系列比較定量。
國標是非消化處理的，是不是稱多點就可以了，但又考慮消化時間可能太長。
1.丁二酮圬(C4H3N202,)一乙醇溶液(10g/L): 2 酒石酸鉀鈉溶液(500 g/L)：
3.氫氧化鈉溶液(100g/L): 4.過硫酸銨溶液(60g/L):臨用現(xiàn)配,
5、鎳標準使用液（1.0ug)：
吸取 0,1，2，4，6，8，10，12，14，16ml鎳標準使用液，分別置于25mL具塞比色管中。
吸試樣多少？
于試樣及標準管中分別依次加人1.25mL酒石酸鉀鈉溶液,3.75mL氫氧化鈉溶液,1.25mL過硫酸銨溶液，混勻，放置3 min。再各加人0.5 mL丁二酮圬一乙醇溶液，加水至25mL,混勻。放置15 min后，用3cm比色杯，以水調(diào)節(jié)零點，于上海美析723N可見分光光度計波長470 nm處測吸光度，繪制標準曲線比較。
4微波消解——分光光度法測定大豆中的硼量
分別吸取0、0.5、1.5、2.5、3.5、5 、6 、7.5mL 硼標準使用液, 于25mL 比色管中；
加5mL 乙酸銨緩沖溶液, 加2.5 mL 甲亞胺溶液, 混勻, 加水至刻度, 搖勻。放置1 h , 于上海美析723N可見分光光度計420 nm 處,測量吸光度。
試樣用(1+1)HN3·H2O 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.5 左右。
1、硼標準使用液(5.0ppm): 2、氨水1+1：
3、乙酸銨緩沖溶液(pH 6.7): 取115 g 乙酸銨, 稀釋到500mL , 再加入33.5g EDTA , 混勻.
4、甲亞胺溶液(9.0 g/L): 現(xiàn)配.稱取1.8g 甲亞胺和4 g抗壞血酸, 于200mL 水中, 微熱溶解。
水質(zhì)硼的測定——甲亞胺-H 酸光度法
本方法的檢出濃度為 0.03ppm， 測定上限為5.0ppm(相當(dāng)于10.0ppm的 HBO2) 可用于飲用水，地面水中硼的測定。錫、碲、汞與顯色試劑生成白色沉淀，鋁鈹鈦鋯釩鎵鉬(VI)生成黃色，銅、鉻生成棕黃色，鐵(III) 鐵(II)均對測定有干擾，可用EDTA加以掩蔽，鉀鈉的存在會減緩反應(yīng)的速度但可延長反應(yīng)時間，在6h 后再進行測定而消除干擾。
原理
在pH5.2 的鹽酸和乙酸銨緩沖溶液中，硼與甲亞胺-H 酸生成可溶于水的甲亞胺H-硼酸棕黃色化合物，其最大吸收波長在410~420nm 處，由于顯色速度慢，6h后發(fā)色完全，該化合物在30h內(nèi)穩(wěn)定。
試劑：
1、乙酸銨水溶液500g/L ： 2、1+4 鹽酸溶液:40ml稀釋至200ml
3、EDTA 飽和溶液: 常溫下溶解度是0.2g/L, EDTA二鈉鹽的溶解度較大，在22℃時，每100毫升水中可镕解11.1克，此溶液的濃度約為0.3moL/L-1。由于EDTA二鈉鹽水溶液中主要是H2Y2-，所以溶液的pH值接近于4.42。其溶解度比較小 受溫度影響比較大長時間存放可認為其溶解度不變， 一般來說是用其鈉鹽酸化后制得飽和溶液。
4、硼標準使用液（10ppm）：
5、甲亞胺-H 酸顯色劑：準確稱取0.50g 甲亞胺-H 酸和2g 抗壞血酸溶于100mL 去離子水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。
測定：
準確移取HBO2標準使用液0 、0.1、0.3、0.625、1.25、2.5、7.5、15ml分別移入25ml比色管；
分別加入0.50mL EDTA 飽和溶液，2.5mL鹽酸溶液(1+4) ，5.0mL 乙酸銨溶液，搖勻后準確加入6.00mL 甲亞胺-H 酸顯色劑，搖勻并用去離水稀釋至標線，搖勻。
測量靜置暗處6h后，用10mm 比色皿于上海美析723N可見分光光度計于420mm 波長處以空白試驗溶液作參比測定吸光度
注意事項
(1) pH 對顯色反應(yīng)有影響適宜的pH 范圍在5.2~5.8
(2) 顯色劑甲亞胺-H 酸易氧化故應(yīng)保存在有塑料壓蓋的棕色瓶中試劑現(xiàn)用現(xiàn)配同時加入抗壞血酸
防止氧化
(3) 當(dāng)HB02 濃度在6.0mg/L 時，在50mL試液中加入6.0mL 的顯色劑是最佳的絡(luò)合比。
(4) 硬質(zhì)玻璃中常含有硼 試樣的預(yù)處理和顯色操作不能用玻璃器皿所使用的玻璃器皿不應(yīng)與試樣溶液作長時間接觸，用其他玻璃器皿時應(yīng)先進行全程序空白試驗用扣除空白的方法以消除玻璃器皿的影響
(5) 配制試劑用的水均需用石英蒸餾器重蒸餾過的水或用去離子水。
5分光光度法測定白花蛇舌草中的鈦含量
準確移取10ppm 的鈦標準使用液0, 1, 2，3, 4, 5 mL 分別置于25 mL 容量瓶中,
各加1∶1 鹽酸10mL、10% 抗壞血酸0.5 mL , 搖勻, 各加2% 二安替比林甲烷5mL , 用水稀釋至刻度, 搖勻靜置30 min 。波長為383 nm.
樣品加10% 抗壞血酸至完全褪色。加2% 二安替比林甲烷5mL , 用水稀至刻度, 搖勻。
1、鈦標準使用液（10ppm）； 2、鹽酸溶液1 mol/L：
3、二安替比林甲烷溶液2%: 準確稱取10.0g 二安替比林甲烷粉末, 用1 mol/L 的鹽酸溶液溶解并定容至500 mL。
6水中微量硅的硅鉬藍光度法測定
硅鉬藍光度法測定硅, 一般在較高酸度下正硅酸與鉬酸銨形成β型黃色硅鉬雜多酸, 用還原劑還原成藍色硅鉬藍, 在上海美析V723N可見分光光度計于波長810～820nm 進行光度法測定。目前, 已知的還原劑種類很多, 且各有優(yōu)缺點, 如氯化亞錫、硫酸亞鐵銨, 還原速度快、靈敏度高, 而穩(wěn)定性差; 抗壞血酸, 硅鉬藍很穩(wěn)定, 而還原速度太慢;硫酸亞鐵和草酸混合作還原劑, 混合液穩(wěn)定時間短; 胺基萘酚磺酸, 硅鉬藍穩(wěn)定時間雖長, 但易產(chǎn)生沉淀而還原能力降低; 米吐爾-Na 2SO3 作還原劑易產(chǎn)生沉淀, 還原速度較慢且不穩(wěn)定。本文研究和配制了甲醛合次硫酸氫鈉和亞硫酸鈉混合液, 作為水中微量硅的(硅鉬藍) 光度法測定的還原劑, 實驗證明其穩(wěn)定性、還原能力、靈敏度、準確度均較好, 還原劑可保存時間較長。
標準硅使用液（20ppm）:
鉬酸銨溶液: 稱取7.2 g 鉬酸銨于50mL 燒杯中, 加10mL 蒸餾水加熱溶解, 趁熱慢慢把它加入5mL濃硫酸和11mL 濃硝酸中, 攪拌均勻, 稍冷后用水稀釋至30mL, 如有渾濁, 放置過夜后過濾.
酒石酸溶液:21g/30ml
甲醛合次硫酸氫鈉(還原劑) 溶液: 稱取1.50 g 甲醛合次硫酸氫鈉和4.0 g 亞硫酸鈉于燒杯中, 加蒸餾水溶解至30mL, 貯于棕色帶滴管小瓶中。
測定：
準確吸取硅標準使用液0，0.2，0.5，0.7，0.9，1.2，1.5 mL 于25mL 比色管中,
加入0.2ml鉬酸銨, 搖勻, 放置4～5min,然后加入0.15ml酒石酸, 搖勻, 放置2min, 再加入0.4ml還原劑, 用蒸餾水稀至刻度, 搖勻, 置于沸水浴中加熱3～5min, 取出流水冷卻至室溫, 在上海美析V723N可見分光光度計于波長810～820nm 和1mL 比色皿中, 用試劑(或蒸餾水) 作參比,測其吸光度A值。
光度法同時側(cè)定磷和硅的研究
磷和硅與鉬酸銨都能生成黃色配合物, 此配合物與還原劑如能同時被還原為鉬藍, 但草酸能迅速破壞磷鉬黃, 且實驗表明, 在0～2ppm范圍內(nèi), 磷鉬藍和硅鉬藍的吸光度加合性良好。故在一定條件下, 先測出磷、硅都存在時的吸光度, 再在相同條件下, 加入草酸,
測出硅鉬藍的吸光度, 二者之差即為磷鉬藍的吸光度, 然后分別在其相應(yīng)的工作曲線上查出對應(yīng)的磷和硅的含量。
鉬酸銨溶液(2.5﹪)：
NaF(0.24﹪)-SnCL2(0.2﹪):2.4g NaF/100ml水，再加0.2g SnCL2,當(dāng)天使用。
草酸溶液（1﹪）：
硫酸（1mol/L）：
磷標準使用液（10ppm）
硅標準使用液（10ppm）
吸0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml的標準使用液于25ml比色管中，
加入1.2ml硫酸（1mol/L）,2.5ml的鉬酸銨溶液, 沸水浴加熱30秒, 10ml NaF(0.24﹪)-SnCL2(0.2﹪),冷卻后稀釋至刻度，搖勻。用1cm比色皿, 上海美析V723N可見分光光度計于690nm處, 以試劑空白為參比測量吸光度.
7鋁
試樣經(jīng)處理后，三價鋁離子在乙酸一乙酸鈉緩沖介質(zhì)中，與鉻天青S及溴化十六烷基三甲胺反應(yīng)形成藍色三元絡(luò)合物，于640nm波長處測定吸光度并與標準比較定量。
1、1%(體積分數(shù))硫酸:0.1ml稀釋至10ml.
2、乙酸一乙酸鈉溶液:稱40.8g乙酸鈉溶于540mL水中，加3.12ml冰乙酸，調(diào)pH至5.5，用水稀釋至600mL,
3、鉻天青S溶液(0.5 g/L):
4、溴化十六烷基三甲胺溶液(0.2 g/L):0.04g/200ml ,必要時加熱助溶。
5、抗壞血酸溶液（10g/L）:臨用時配。
6、鋁標準使用液（1.0ppm）：
應(yīng)保證試樣溶液中含1﹪硫酸.
吸取 0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,6.0m L鋁標準使用液(相當(dāng)于含0, 0.5, 1.0,2.0,4.0,6.0ug)分別置于25mL比色管中，依次向各管中加人1mL 1%硫酸溶液。
吸取1.0 mL消化好的試樣液，置于25mL比色管中。
向標準管、試樣管、試劑空白管中依次加人8.0 ml乙酸一乙酸鈉緩沖液,1.0 ml抗壞血酸溶液，混勻，加2.0 mL溴化十六烷基三甲胺溶液，混勻，再加2.0mL鉻天青S溶液，搖勻后，用水稀釋至刻度。室溫放置20min后，用1cm比色杯，于分光光度計上，以零管調(diào)零點，上海美析V723N紫外可見分光光度計于640 nm波長處測其吸光度，繪制標準曲線比較定量。
8鋅 ----雙硫腙比色法(一次提取)
樣品經(jīng)消化后,在pH4.0～5.5時,鋅離子與雙硫腙形成紫紅色絡(luò)合物,溶于四氯化碳，加入硫代硫酸鈉，防止銅、汞、鉛、鉍、銀和鎘等離子干擾，與標準系列比較定量。
二：試劑：
1.乙酸鈉溶液(2 mol/I):稱取68 g乙酸鈉(CH,COONa·3H,O)，加水溶解后稀釋至250 mL,
2.乙酸(2mol/L):量取10.0 mL冰乙酸，加水稀釋至85mL,
3.乙酸一乙酸鹽緩沖液:乙酸鈉溶液(2 mol/L)與乙酸(2 mol/L)等量混合，此溶液pH為4. 7左右。用二硫腺一四氯化碳溶液(0. 1 g/L)提取數(shù)次，每次10 mL,除去其中的鋅，至四氯化碳層綠色不變?yōu)橹?，棄去四氯化碳層，再用四氯化碳提取乙酸一乙酸鹽緩沖液中過剩的二硫蹤，至四氯化碳無色，棄去四氯化碳層。
4.硫代硫酸鈉溶液(250 g/L):乙酸鈉溶液(2 mol/L)與乙酸(2 mol/L)等量混合，此溶液pH為4. 7左右。用二硫腺一四氯化碳溶液(0. 1 g/L)提取數(shù)次，每次10 mL,除去其中的鋅，至四氯化碳層綠色不變?yōu)橹梗瑮壢ニ穆然紝?，再用四氯化碳提取乙酸一乙酸鹽緩沖液中過剩的二硫蹤，至四氯化碳無色，棄去四氯化碳層。
5. 1:1氨水
6.甲基橙指示液(2 g/L):稱取0.2 g甲基橙，用乙醇(20%)溶解并稀釋至100 Ml
7.鹽酸(2 mol/L):量取10 mL鹽酸，加水稀釋至60 mL,
8.鋅標準使用液（1.0ug）:
10. 二硫蹤一四氯化碳溶液(0.01g/L)。
吸取5.0～10.0mL定容的消化液和相同量的試劑空白液, 分別置于25mL比色管中；
吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL鋅標準使用液(相當(dāng)0、1、2、3、4、5μg鋅),分別置于25mL比色管中。
于樣品消化液、試劑空白液及鋅標準液中各加1滴甲基橙指示液，用氨水調(diào)至由紅變藍，再各加5mL乙酸-乙酸鹽緩沖液及1mL硫代硫酸鈉溶液混勻后, 各加10.0mL0雙硫腙-四氯化碳溶液，定容至25ml.劇烈振搖4min，靜置分層，經(jīng)脫脂棉將四氯化碳層濾入1cm比色杯中,以四氯化碳調(diào)節(jié)零點,于上海美析V723N可見分光光度計波長530nm處測吸光度,繪制標準曲線比較。
鋅試劑- 環(huán)己酮分光光度法測定乳制品奶粉中的鋅
吸取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0ml鋅標準液；
各加入2滴酚紅指示劑用氫氧化鈉(40 g/L)溶液調(diào)至紅色,再用鹽酸( 1+50)調(diào)至黃色,加入0.5克抗壞血酸, 5.0ml緩沖液, 2.0 ml氰化鉀溶液(10 g/L)和3.0 ml鋅試劑溶液再加入1.5 ml環(huán)己酮。混勻,放置15min用1 cm 比色皿,以試劑空白為參比于上海美析V723N可見分光光度計620 nm波長測定吸光度。
1、酚紅的乙醇溶液(1 g/L)：
2、氫氧化鈉(40 g/L)： 3、鹽酸(1+50)： 4、抗壞血酸
5、緩沖液：稱取42 g粒狀氫氧化鈉,溶于水, 加入155 g 硼酸, 溶解后再加純水至500 ml;所用試劑均為分析純,實驗用水為純水。
6、氰化鉀溶液(10 g/L)： 7、鋅標準使用液（10.0ppm）：
8、鋅試劑溶液：紫棕色結(jié)晶性粉末。溶于乙醇和堿，溶于氫氧化鈉呈紅色，不溶于水。遇鋅生成藍色化合物，稀時為溶液，濃時為深藍色沉淀。
9微波消解- 紫外分光光度法測定水中總氮
取一定量水樣于聚四氟乙烯密封消解罐中, 加水至25 mL, 搖勻。
分別取0.、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、12.0、13.0、15.0 mL氮標準使用液于聚四氟乙烯密封消解罐中, 加水至25 mL, 搖勻。
依次加入0.50 mL H2O2 , 0.50mL 9 mol/L硫酸溶液, 加蓋密封后于微波消解爐中10檔加熱8 min, 冷卻至室溫。注入10 mm石英比色皿中, 分別在上海美析UV762紫外可見分光光度計的220和275 nm處測定其吸光度, 用雙波長紫外分光光度法進行總氮測定。氮含量在0.024 2～9.60ppm之間時與吸光度成線性關(guān)系,以去離子水代替試樣做空白試驗。
過氧化氫是用于消解水中的有機物質(zhì)包括含氮有機物的, 因此其用量是一個重要的控制因素。實驗發(fā)現(xiàn), 在過氧化氫用量為0.40～0.80 mL之間吸光度基本保持不變,
酸性條件下, 過氧化氫具有較強的氧化性; 但酸性過強, 又不利于NH4+ 轉(zhuǎn)化為NO3- 。
1、氮標準使用液: 20 mg/L硝酸鉀標樣;
2、硫酸溶液（9 mol/L;）
3、過氧化氫溶液（0.3 g/mL）;
4、本實驗用水均為無氨水
10氟——灰化蒸餾— 氟試劑比色法
試樣經(jīng)硝酸鎂固定氟，經(jīng)高溫灰化后，在酸性條件下，蒸餾分離氟，蒸出的氟被氫氧化鈉溶液吸收，氟與氟試劑、硝酸鑭作用，生成藍色三元絡(luò)合物，與標準比較定量。
本方法所用水均為不含氟的去離子水，試劑為分析純，全部試劑貯于聚乙烯塑料瓶中。
1 丙酮:需500ml.
2 鹽酸(1+11):取10mL鹽酸，加水稀釋至120mL.
3 乙酸鈉溶液(250g/L)： 4 乙酸溶液(1mol/L):取3ml,稀釋至50mL.
5.氫氧化鈉溶液(40g/L)：
6 茜素氨羧合劑溶液: 現(xiàn)配。稱取0.19 g茜素氨羧絡(luò)合劑，加少量水及氫氧化鈉溶液(40 g/L)使其溶解，加0.125g 乙酸鈉，用乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為5.0(紅色)，加水稀釋至500ml。
7 硝酸鎂溶液(100 g/L):
8 硝酸鑭溶液: 現(xiàn)配。稱取0.11 g硝酸斕，用少量乙酸溶液溶解，加水至約225 ml，用乙酸鈉溶液(250 g/L)調(diào)節(jié)pH為5.0，再加水稀釋至250mL。
9 緩沖液(pH4. 7):稱取30 g無水乙酸鈉，溶于400 mL水中，加22 mL冰乙酸，再緩緩加冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4. 7，然后加水稀釋至500mL.
10 氫氧化鈉溶液(100 g/L):
11 酚酞一乙醇指示液(10 g/L):
12 硫酸(2+1):
13、氟標準使用液（5.0ppm）：
稱取混勻試樣5.00g (以鮮重計)，于30m1坩堝內(nèi)，加5.0 m L硝酸鎂溶液和0.5m L氫氧化鈉溶液(100 g/L)、使呈堿性，混勻后浸泡0.5 h，置水浴上蒸干，再低溫炭化，至完全不冒煙為止，移人馬弗爐中，600度灰化6h，取出，放冷。
于坩堝中加10m L水，將數(shù)滴硫酸(2十1)慢慢加人坩堝中，防止溶液飛濺，中和至不產(chǎn)生氣泡為止。將此液移人500mL蒸餾瓶中，用20mL水分數(shù)次洗滌坩堝，并入蒸餾瓶中。
于蒸餾瓶中加60mL硫酸(2+1)，數(shù)粒無氟小玻珠，連接蒸餾裝置，加熱蒸餾。餾出液用事先盛有5 mL水、7滴~20滴氫氧化鈉溶液(100 g/L)和1滴酚酞指示液的50mL燒杯吸收，當(dāng)蒸餾瓶內(nèi)溶液溫度上升至190℃時停止蒸餾(整個蒸餾時間約15 min-20 min),
取下冷凝管，用滴管加水洗滌冷凝管3次~4次，洗液合并于燒杯中。再將燒杯中的吸收液移人50 mL容量瓶中，并用少量水洗滌燒杯2次~3次，合并于容量瓶中。用鹽酸(1+11)中和至紅色剛好消失。用水稀釋至刻度，混勻。
吸取0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0 mL氟標準使用液(相當(dāng)0,1,3，5,7，9ug氟) 于25 mL帶塞比色管中。
分別吸取試樣蒸餾液各10.0 mL于25 mL帶塞比色管中。
各加2.OmL茜素氨羧絡(luò)合劑溶液、3.0 mL緩沖液、6.0 mL丙酮、2.0 m L硝酸鑭溶液，再加水至刻度，混勻，放置20m in，以3cm比色杯(參考波長580nm)用零管調(diào)節(jié)零點，測各管吸光度，繪制標準曲線比較。
葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下使鄰聯(lián)甲苯胺生成藍色物質(zhì)，此有色物質(zhì)在625nm 波長下與葡萄糖濃度成正比。通過測定藍色物質(zhì)的吸光度可計算樣品中葡萄糖的含量。
2.適用范圍
適用于谷類、乳類、飲料、酒類等食物樣品和血液樣品。檢出量為0.02 mg。
3.儀器
上海美析722分光光度計。
4.試劑：
除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。
（1） 乙醇。
（2） 40% 三氯乙酸：稱取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀釋至100ml。
（3） 2 mol/L NaOH 溶液：稱取8g NaOH， 用水溶解并稀釋至100ml。
（4） 1 % 鄰聯(lián)甲苯胺溶液：稱取0.1 g 鄰聯(lián)甲苯胺溶解于10 ml無水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。
（5） 乙酸緩沖液 （pH 5.0）：稱取14.28 g 乙酸鈉 （CH3COONa?3H2O）溶于水中，加入2.7 ml 冰乙酸，并調(diào)節(jié)pH 5.0， 用水定容至1 L。
（6） 葡萄糖氧化酶溶液：稱取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma 公司）用水溶解，使酶含量為100 U/ml。4 ℃ 冰箱保存一周。
（7） 過氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根過氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。
（8） 酶溶液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃ 冰箱可保存七周。
（9） 酶空白液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃ 冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）
（10） 葡萄糖標準液：將葡萄糖標準品（純度大于99%）于80 ℃干燥至恒量。精確稱取0.050 g，用水移入100 ml 容量瓶中，定容至刻度線。相當(dāng)于濃度為0.5 mg/ml。
5.操作步驟：
5.1樣品處理：
（1）固體樣品：稱取0.5～5g已粉碎的樣品于錐形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷卻后，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反復(fù)搖動混勻樣品，過濾，棄初始幾滴濾液。收集濾液。如果濾液澄清，可直接或經(jīng)進一步稀釋后用于測定。如果濾液渾濁，吸取20ml濾液轉(zhuǎn)移至另一容量瓶中，加入無水乙醇至刻度。混合后靜置至少30min。過濾，濾液用于測定。
（2） 液體樣品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml樣品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。靜置至少30min，過濾后濾液備用。（如果過濾后濾液仍渾濁，或樣液體積過少，可3000rpm離心15 min，上清液備用。）
（3） 新鮮牛乳等樣品：吸取0.5～2ml 樣品，用水稀釋，加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml，過濾。吸取5ml 濾液，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至中性，用水定容至10ml，備用。
（注：樣品處理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白質(zhì)，40% 三氯乙酸用于沉淀蛋白。）
5.2測定：標準管和樣品測定管，按下表所列操作（單位：ml）
試 劑 標準空白管 葡萄糖標準管 樣品空白管 樣品測定管
葡萄糖標準液 —— 0.1～0.5 —— ——
樣品提取液 —— —— 0.5 0.5
水 0.5 補至0.5 —— ——
酶溶液 5 5 —— 5
酶空白液 —— —— 5 ——
上述試劑混合后37℃ 水浴反應(yīng) 15 min， 625 nm 測定吸光度值。
（注意：葡萄糖與酶溶液的成色反應(yīng)與反應(yīng)時間密切相關(guān)，如反應(yīng)時間過長，溶液顏色會由藍轉(zhuǎn)變成灰色，并慢慢產(chǎn)生沉淀，所以反應(yīng)時間應(yīng)嚴格控制好。）
6.計算
根據(jù)吸光度值求出葡萄糖標準曲線的回歸方程，采用插入法求出樣品測定管中葡萄糖含量，再根據(jù)稀釋定容體積和稱樣量，計算出樣品中葡萄糖含量。
計算公式：
X= (As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中:
X——樣品中葡萄糖含量，g/100g;
As—— 由標準回歸方程求出的樣品測定管中葡萄糖含量，mg；
Ab——由標準回歸方程求出的樣品空白管中葡萄糖含量，mg；
V——樣品定容體積，ml；
F——稀釋倍數(shù)
0.5——測定時吸取樣品提取液的體積，ml；
m——樣品質(zhì)量，g；
0.1——將mg/g轉(zhuǎn)換成g/100g的系數(shù)。
7.注意事項
（1） 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反應(yīng)，特異性強，靈敏度高。
（2） 如果樣品提取液為無色，無需做樣品空白。但是有些樣品顏色很深，如飲料、菌藻類食物，或樣品提取液渾濁，往往干擾測定結(jié)果但又難以去除，所以測定這類樣品時需做樣品空白管以減少干擾。
此處介紹蔬菜中維生素K1的測定方法（HPLC法）和食物及飼料中水溶性維生素K3（甲萘醌）的測定方法
一、蔬菜中維生素K1的測定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的維生素K1經(jīng)有機溶劑提取后，經(jīng)失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁色譜柱進行凈化，再用液相色譜法將維生素K1分離并進行定性定量測定。
2.適用范圍
本標準適用于各類蔬菜、綠色植物及其干制品中維生素K1的測定。
3. 儀器：
（1） 實驗室常用設(shè)備
（2） 打碎機
（3） 202-R型恒溫干燥箱
（4） 色譜柱：為0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收縮變細，并裝有活塞，活塞上約1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm，柱上端膨大為容積約30ml的儲液池。使用前需干燥
（5） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器
與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶：具塞，圓底，容積為150ml。
（6） 恒溫水浴鍋
（7） 高純氮氣
（8） 高速離心機
與高速離心機配套的小離心管：具塞，容積為1.5～3.0ml。
（9） 上海美析UV762紫外分光光度計
（10） HPLC：高效液相色譜儀，帶紫外檢測器
4.試劑
除特殊說明實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純，有機溶劑使用前需重新蒸餾。
3.1 無水硫酸鈉：使用前需在150℃的烘箱內(nèi)烘烤4～8小時，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：稱取20g無水硫酸鈉，用蒸餾水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析純。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析純。
3.5 0.6mol/L碘化鉀溶液：稱取10g碘化鉀，用蒸餾水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：稱取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析純。不含過氧化物。
（1） 過氧化物的檢查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色。或加4滴5g/L淀粉液，水層呈藍色。則該乙醚含有過氧化物需處理后使用。
（2） 去除過氧化物的方法：重蒸時瓶中加一段純鐵絲，棄去10%初餾液和10%殘留液。
3.8 洗脫液：石油醚+乙醚（97+3）。
3.9 甲醇：優(yōu)級純。
3.10 正己烷：優(yōu)級純。
3.11 磷酸氫二鈉：分析純。
3.12 中性氧化鋁：100～200目。
3.13 氧化鋁的處理：
（1） 磷酸鹽處理氧化鋁：取250g中性氧化鋁，20g磷酸氫二鈉，1.6L蒸餾水，放入容積為2L的錐形瓶中沸水浴30min，不時搖動或攪拌。冷卻，倒掉上層液體（包括懸浮的細小顆粒），然后用布氏漏斗抽濾。將殘留物轉(zhuǎn)至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至兩次稱量相差3g以下，烘烤過程中不時攪拌，以避免結(jié)塊，冷卻后放入干燥器中保存。
（2） 失活處理氧化鋁：使用前，將磷酸鹽處理的氧化鋁，加入具塞錐形瓶中。每100g氧化鋁加9.0ml去離子水，蓋緊瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加熱3～5min，劇烈搖動錐形瓶，使氧化鋁可以自由流動，無結(jié)塊。冷卻，靜置30分鐘，使水分分布均勻。
（3） 驗證處理過的氧化鋁：取標準應(yīng)用液1.0ml，用氮氣吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3裝柱，將標準溶液加入柱上，按5.4凈化步驟進行柱色譜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集洗脫流出液，濃縮，氮氣吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC測定，記錄峰面積或峰高（A）。另取標準應(yīng)用液直接測定，記錄峰面積或峰高（Ar）。將A與Ar進行比較，其值在0.97～1.03之間（A/Ar），則說明柱效較好，氧化鋁處理合格。否則需重新進行失活處理。如果再次驗證比值仍不能達到0.97，則需重新制備氧化鋁。
3.14 維生素K1標準：Sigma公司，純度>98%。
3.15 標準貯備液：精確稱取50.0mg維生素K1標準，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。將儲備液分裝成安瓿，冷凍保存。
3.16 標準工作液：取標準貯備液， 用正己烷準確稀釋50倍, 即20.0μg/ml。
標準工作液的標定：取標準應(yīng)用液測定紫外吸光值，波長248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷為空白，測定3次，取平均值，按下式計算標準應(yīng)用液濃度。
X1 = A ×M ×103 ……………………………………(1)
E
式中： X1 -- 維生素K1標準應(yīng)用液濃度，μg/ml；
A -- 標準應(yīng)用液平均紫外吸光值；
E -- 摩爾消光系數(shù)，20,000；
M -- 維生素K1分子量450.7；
103 -- 換算成μg/ml的換算系數(shù)。
5.操作步驟
所有操作均需避光進行
5.1 樣品處理
（1） 新鮮蔬菜：揀凈去雜物，將可食部洗凈，擦去表面水分，切碎，用打碎機制備成勻漿。
（2） 干制植物性樣品：磨碎,過60目篩。
5.2 樣品提取
（1） 稱取已打成勻漿的新鮮樣品2～10g（維生素K1含量不低于2μg），加到具塞錐形瓶中,再加入5～10倍體積的丙酮,蓋上塞子,振搖3～5min，靜置1min，以下按5.3步驟操作。
（2） 稱取干制植物性樣品0.2～4g（維生素K1含量不低于2μg）,加到研缽中，再加入2～4倍于樣品量的無水Na2SO4研磨均勻后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，靜置1min。
（注：對于細胞壁比較厚的樣品，如藻類食品，可先用石英砂研磨，破壞植物組織細胞。石英砂需進行預(yù)處理，將石英砂用20目篩子過篩之后，先用濃鹽酸浸泡，然后再用稀氫氧化銨浸泡，最后用蒸餾水洗至中性后在烘箱中烤干。使用時，每10g樣品加3～5g石英砂于研缽中研磨。）
5.3 洗滌
將上部澄清液倒入已裝有50～100ml 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中，殘渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。殘渣繼續(xù)用石油醚洗滌3～4次，每次用量約25ml，至洗滌液呈無色，將洗滌液倒入同一分液漏斗中，振搖1min，靜置。棄水相，有機相用蒸餾水洗滌4～5遍，至水相澄清。棄水相，將有機相經(jīng)無水Na2SO4脫水后轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于60℃水浴中減壓蒸餾至約2ml時取下，立即用氮氣吹干，用石油醚定容至2.0 ml，待凈化。
5.4 裝柱
取干燥色譜柱，將驗證好的氧化鋁浸泡于石油醚中，濕法填充于色譜柱，使氧化鋁自由均勻流下，至柱高為20cm，其上端再加2 cm無水Na2SO4。打開活塞，調(diào)整流速為每秒1滴。一根色譜柱只用于一個樣品測定。
5.5 色譜凈化：待石油醚流至柱上端0.5cm時，加V1 ml樣品提取液，當(dāng)樣品液流至柱平齊時，加2 ml石油醚沖洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脫，2次，棄除流出液。然后，用30 ml洗脫液洗脫，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集流出液。流出液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮近干，取下用氮氣吹干后，用正己烷定容為V2 ml。將定容液移入小塑料離心管中，5000rpm離心5min，上清液供HPLC分析。
5.6 標準工作曲線的繪制
分別取維生素K1標準應(yīng)用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步驟提取，濃縮定容至2.0ml。取1.0ml標準提取液按5.4步驟操作，最后定容至1.0ml，即標準工作曲線中各點維生素K1含量分別相當(dāng)于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6條件進行HPLC測定，記錄峰面積或峰高。以標準含量為橫坐標，峰面積或峰高為縱坐標繪制標準工作曲線。
5.7 HPLC色譜分析
色譜條件（推薦條件）：
預(yù)柱ultrapack ODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流動相：甲醇+正己烷（98+2）?；靹?，臨用前脫氣。
進樣量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外檢測器：波長248nm。量程0.01～0.05。
HPLC穩(wěn)定性的測定：取標準應(yīng)用液連續(xù)進行6次HPLC測定，計算峰面積或峰高的平均值、標準差和RSD%，如果RSD<1%，說明儀器穩(wěn)定性良好。儀器穩(wěn)定后方可進行樣品測定。
5.8 樣品分析
取樣品凈化液20μl，按色譜條件進行定性、定量分析。
（1） 定性：用標準色譜峰的保留時間定性。
（2） 定量：用樣品峰面積或峰高在標準工作曲線上查出其相應(yīng)的維生素K1含量，或用回歸方程求出其含量。
6.計算
c×2×V2 ×100
X 2＝ ………………………………（2）
V1 ×m
式中： X2 -- 樣品中維生素K1的含量,μg/100g;
c -- 由標準工作曲線上查出或回歸方程求出的維生素K1含量,μg;
2 -- 樣品提取后的定容體積,ml;
V1 -- 樣品凈化處理時的取液量,ml;
V2 -- 樣品凈化后的定容體積,ml;
m -- 樣品質(zhì)量,g。
7. 注意事項
（1） 7.1允許差及最小檢出量: 同一實驗室同時或連續(xù)2次測定結(jié)果相對偏差絕對值≤10%，本法最小檢出限為0.5mg。
（2） 本方法避免使用皂化處理，減少了維生素K1的破壞；利用失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁進行色譜分離，通過改變洗脫液的極性使維生素K1與雜質(zhì)分離，有利于高效液相色譜對維生素K1的定性及定量分析。
（3） 維生素K1具有很強的親脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、異辛烷等溶劑中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶劑中。當(dāng)樣品中含有較多的水分時，如直接用石油醚或正己烷提取會使樣品變粘，因此，樣品需先用丙酮提取，或先用無水Na2SO4研磨，然后再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，進一步地破壞樣品的細胞組織，使提取效果更佳。
（4） 以往的報告多選用活性硅膠或中性氧化鋁做色譜柱分離維生素K1，再用極性小的有機溶劑作洗脫液。實際工作中發(fā)現(xiàn)，用硅膠色譜柱，洗脫流速慢，洗脫液用量大，分離時間較長；用未經(jīng)處理的氧化鋁色譜柱分離會出現(xiàn)維生素K1與干擾物分離不清的現(xiàn)象。當(dāng)氧化鋁用磷酸鹽處理后，氧化鋁的極性增強，使吸附較小的維生素K1易于被洗脫液洗脫出來，而且在處理后的氧化鋁中加入少量水分可以提高柱效，減少維生素K1出峰拖尾的現(xiàn)象，縮短保留了時間，避免了因使用氧化鋁造成的維生素K1可能分解的現(xiàn)象。
（5） 如果氧化鋁色譜柱柱效良好，首先被石油醚洗脫出來的應(yīng)是胡蘿卜素，且柱上沒有胡蘿卜素黃色帶擴散的現(xiàn)象；葉綠素及其他色素停留在色譜柱的上方?jīng)]有或僅有少量位移但不影響分離效果。
（6） 洗脫液中乙醚含量的多少影響著洗脫液的極性，如果乙醚含量少，可使維生素K1的保留時間延長，反之，會使干擾物質(zhì)被提前洗脫，影響凈化效果。所以應(yīng)嚴格控制洗脫液中乙醚的比例。
（7） 根據(jù)標準維生素K1紫外掃描圖譜，可見維生素K1于240，248nm，260，269nm波長處有4個特征峰，其中260nm的峰最低。將標準品用HPLC測定，以260nm波長下的峰面積為1，則240nm, 248nm和269nm波長下的峰面積分別為1.15，1.23，1.09。
（8） 一般反相色譜，多用有極性的甲醇作為流動相。在甲醇中加入適量的非極性有機溶劑（如正己烷、異辛烷等），可以增加維生素K1 的溶解能力，有利于縮短保留時間，減少出峰拖尾現(xiàn)象。本方法選擇甲醇+正己烷（98+2）作為流動相，維生素K1的保留時間為15.6±0.1min。
（9） 本方法最小檢測限為0.5μg/ml，在1.0～100.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積有良好的線形關(guān)系。批間測定結(jié)果的相對標準偏差在1.3～7.1% （n=6）；回收率為90.9～106.3%。。不同實驗室間測定結(jié)果表明此方法精密度、重現(xiàn)性較好，凈化效果好，試劑價格適中。
總膽堿的測定
比色法
1.原理
食物中的膽堿經(jīng)過堿處理提取后，通過Florisil柱色譜純化，然后用雷納克鹽（reineckate）與膽堿反應(yīng)形成粉紅色的膽堿-雷納克鹽復(fù)合物，這種復(fù)合物被丙酮洗脫后，在526nm有最大吸收，其吸收值與膽堿濃度成正比。
2.適用范圍
參照《Methods of Vitamin Assay》。使用于各類食物中膽堿的測定。最小檢出限為0.15mg。
3. 儀器與設(shè)備
（1） 實驗室常用設(shè)備。
（2） 回流提取裝置。
（3） 色譜柱：為0.8cm（內(nèi)徑）×30cm的玻璃柱，柱上端為容積30～50ml的儲液池，底端收縮變細，并裝有活塞?；钊霞s1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm。
（4） 上海美析723N可見分光光度計。
4. 試劑
除特殊說明外，所有試劑均為分析級，實驗用水為蒸餾水。
（1） 甲醇。
（2） 氯仿。
（3） 乙酸甲酯。
（4） 丙酮：用前重蒸餾。
（5） 10% 丙酮： 取50ml丙酮溶解于450ml水中。
（6） 冰乙酸。
（7） 冰乙酸-甲醇溶液：取50ml冰乙酸和400ml甲醇混合。
（8） 飽和氫氧化鋇提取液：于1000ml甲醇中加入40g無水Ba(OH)2，攪拌10min,再加入100ml氯仿，混合，使Ba(OH)2飽和，過濾去除多余的Ba(OH)2。
（9） 硅鎂吸附劑（Florisil）：Sigma 公司，60～100目。
（10） 雷納克銨（Ammonium Reineckate）飽和溶液：稱取2～3g雷納克銨，加入100ml水中，攪拌10min ,過濾去除多余的雷納克銨。實驗當(dāng)日配制。
（11） 膽堿標準貯備液（5g/L）：準確稱取無水氯化膽堿0.57613g，溶解于水中，并定容至100mL。冰箱保存。
（12） 膽堿標準工作液（1g/L）：準確吸取2.0ml標準貯備液，用水稀釋定容至100ml。
5.測定步驟
所有操作均需避光進行
5.1 提?。悍Q取適量樣品（約含5～50mg膽堿），置于100ml具塞錐型瓶中，加入30ml提取液，邊加邊搖，避免結(jié)塊。然后放置于76℃～80℃恒溫水浴回流2～4h，回流速度為1～2滴/秒。（注：加熱回流的溫度應(yīng)嚴格控制在80℃左右，否則樣品易撲濺，造成損失。樣品提取率與回流時間有關(guān)，回流2小時，提取率達到最高值，回流3～4小時，可以保證樣品提取較完全。）冷卻，樣品過濾至100ml容量瓶中，反復(fù)用5～10ml冰乙酸-甲醇溶液洗滌錐形瓶和濾渣，濾液并入容量瓶中。用pH試紙測定提取液pH在2～6范圍之內(nèi)（必要的話可加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH），然后用甲醇定容至刻度。
5.2 純化
（1） 填裝色譜柱：將硅鎂吸附劑浸入甲醇中，濕法將硅鎂吸附劑填充入色譜柱中（注：色譜柱最好經(jīng)過干燥處理，否則影響洗脫液流速），至硅鎂吸附劑的高度達10cm（約4g）。用甲醇沖洗色譜柱，并保持甲醇高于硅鎂吸附劑頂端0.5～1cm。
（2） 柱色譜純化：吸取一定量的提取液加到色譜柱中，打開底端活塞，使提取液靠重力作用通過色譜柱。先后用5ml，10ml甲醇洗滌色譜柱。待甲醇通過色譜柱后，依次用2份10ml乙酸甲酯，10ml冷的10%丙酮洗滌色譜柱。接著加入5ml雷納克銨飽和溶液（雷納克銨與吸附于色譜柱上的膽堿結(jié)合），待雷納克銨飽和溶液完全通過色譜柱后，用2份10ml冰乙酸洗滌直至流出液清亮為止（冰乙酸的作用是洗脫未與膽堿結(jié)合的過量的雷納克銨，應(yīng)注意洗脫完全）。用15ml丙酮洗脫色譜柱上膽堿-雷納克鹽復(fù)合物的粉紅色色譜帶，收集洗脫液，并用丙酮定容至15ml。
5.3 比色測定：用1cm比色杯，以丙酮調(diào)節(jié)零點，于526cm波長下，測定樣品吸光度，其值在標準工作曲線上查出，或通過回歸方程計算出對應(yīng)的膽堿含量，供計算使用。
5.4標準工作曲線：分別吸取0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml標準工作液（3.13），加至色譜柱上，按照上述樣品測定步驟操作。以膽堿含量做橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。
6.計算
C ×V1×100
X= -------- ×100
V2 × m
式中：
X--樣品中膽堿的含量，（mg/100g）；
C--從標準工作曲線或回歸方程中查到的膽堿含量，mg；
V1--樣品提取液的總體積，ml
V2--純化用提取液的體積，ml；
m--樣品質(zhì)量，g
7.注意事項
（1） 同一實驗室平行測定或重復(fù)測定結(jié)果的相對偏差絕對值＜10%。
（2） 硅酶吸附劑填充的高度關(guān)系到洗脫液的用量，如果填充過高，則應(yīng)加大洗脫液用量，以保證膽堿的純化和完全洗脫。
（3） 純化過程中冰乙酸的作用是將不能與膽堿形成復(fù)合物的多余雷納克銨鹽洗脫，丙酮則是洗脫膽堿-雷納克銨復(fù)合物，如果這兩步洗脫不完全，均影響膽堿的測定，所以必要時應(yīng)增加冰乙酸和丙酮的用量以保證測定結(jié)果。
試樣經(jīng)消化后，在弱酸性溶液中四價錫離子與苯芴酮形成微溶性橙紅色絡(luò)合物，在保護性膠體存在下與標準系列比較定量。
1、酒石酸溶液(100 g/L)： 2、抗壞血酸溶液(10 g/L):臨用時配制。3、動物膠溶液(5 g/L):臨用時配制。
4、酚酞指示液(10 g/L):用乙醇溶解。 5、氨水(1+1)
6、硫酸(1+9): 7、苯芴酮溶液(0.1g/L):稱取0.020 g苯芴酮（1,3,7一三羥基一9一苯基蒽醌)，加少量甲醇及硫酸（1+9）數(shù)滴溶解，以甲醇稀釋至200 mL。
8、錫標準使用液（10.0ppm）：
吸取 1.00mL-5.00mL試樣消化液和同量的試劑空白溶液，分別置于25mL比色管中。
吸取 0, 0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL錫標準使用液(相當(dāng)0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0ug錫)，分別置于25mL比色管中。
于試樣、消化液、試劑空白液及錫標準液中各加0.5 mL酒石酸溶液(100g/L)及1滴酚酞指示液，混勻，各加氨水(1+1)中和至淡紅色，加3 mL硫酸(1+9),1mL動物膠溶液及2.5 mL抗壞血酸溶液，再加水至25mL_，混勻，再各加2 mL苯芴酮溶液，混勻，1小時后測量，用2 cm比色杯以水調(diào)節(jié)零點，用上海美析723N可見分光光度計于波長490 nm處測吸光度，標準各點減去零管吸光值后，繪制標準曲線或計算直線回歸方程，試樣吸光值與曲線比較或代人方程求出含量。
2磷
食物中的有機物經(jīng)酸氧化，使磷在酸性條件下與鉬酸銨結(jié)合生成磷鉬酸銨。此化合物被對苯二酚、亞硫酸鈉還原成藍色化合物——鑰藍。用上海美析723N可見分光光度計在波長660 nm處測定鑰藍的吸收光值。
1、15%硫酸溶液: 2、鑰酸銨溶液:1g/200ml,用15%硫酸溶液稀釋。
3、亞硫酸鈉溶液:20g/100ml,臨時配制，否則可使鑰藍溶液發(fā)生混濁.
4、磷標準使用液（10.0ppm）：
吸取0.625，1.25，2.5，3.75，5，6.25 ml磷標準使用液(相當(dāng)于含磷量0，5,10,20,30,40,50ug)分別置于25mL具塞試管中。
準確吸取試樣測定液2.5mL及同量的空白溶液，分別置于25ml具塞試管中。
依次加人2.5mL鉬酸溶液搖勻，靜置幾秒鐘。加人1.25 ml亞硫酸鈉溶液，1.25 mL對苯二酚溶液，搖勻。加水至刻度，混勻。靜置30分鐘以后，在分光光度計660 nm波長處測定吸光度。以測出的吸光度對磷含量繪制標準曲線。
3鎳
試樣中的鎳用稀酸提取后，在強堿性溶液中以過硫酸銨為氧化劑，鎳與丁二酮杇形成紅褐色絡(luò)合物，與標準系列比較定量。
國標是非消化處理的，是不是稱多點就可以了，但又考慮消化時間可能太長。
1.丁二酮圬(C4H3N202,)一乙醇溶液(10g/L): 2 酒石酸鉀鈉溶液(500 g/L)：
3.氫氧化鈉溶液(100g/L): 4.過硫酸銨溶液(60g/L):臨用現(xiàn)配,
5、鎳標準使用液（1.0ug)：
吸取 0,1，2，4，6，8，10，12，14，16ml鎳標準使用液，分別置于25mL具塞比色管中。
吸試樣多少？
于試樣及標準管中分別依次加人1.25mL酒石酸鉀鈉溶液,3.75mL氫氧化鈉溶液,1.25mL過硫酸銨溶液，混勻，放置3 min。再各加人0.5 mL丁二酮圬一乙醇溶液，加水至25mL,混勻。放置15 min后，用3cm比色杯，以水調(diào)節(jié)零點，于上海美析723N可見分光光度計波長470 nm處測吸光度，繪制標準曲線比較。
4微波消解——分光光度法測定大豆中的硼量
分別吸取0、0.5、1.5、2.5、3.5、5 、6 、7.5mL 硼標準使用液, 于25mL 比色管中；
加5mL 乙酸銨緩沖溶液, 加2.5 mL 甲亞胺溶液, 混勻, 加水至刻度, 搖勻。放置1 h , 于上海美析723N可見分光光度計420 nm 處,測量吸光度。
試樣用(1+1)HN3·H2O 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.5 左右。
1、硼標準使用液(5.0ppm): 2、氨水1+1：
3、乙酸銨緩沖溶液(pH 6.7): 取115 g 乙酸銨, 稀釋到500mL , 再加入33.5g EDTA , 混勻.
4、甲亞胺溶液(9.0 g/L): 現(xiàn)配.稱取1.8g 甲亞胺和4 g抗壞血酸, 于200mL 水中, 微熱溶解。
水質(zhì)硼的測定——甲亞胺-H 酸光度法
本方法的檢出濃度為 0.03ppm， 測定上限為5.0ppm(相當(dāng)于10.0ppm的 HBO2) 可用于飲用水，地面水中硼的測定。錫、碲、汞與顯色試劑生成白色沉淀，鋁鈹鈦鋯釩鎵鉬(VI)生成黃色，銅、鉻生成棕黃色，鐵(III) 鐵(II)均對測定有干擾，可用EDTA加以掩蔽，鉀鈉的存在會減緩反應(yīng)的速度但可延長反應(yīng)時間，在6h 后再進行測定而消除干擾。
原理
在pH5.2 的鹽酸和乙酸銨緩沖溶液中，硼與甲亞胺-H 酸生成可溶于水的甲亞胺H-硼酸棕黃色化合物，其最大吸收波長在410~420nm 處，由于顯色速度慢，6h后發(fā)色完全，該化合物在30h內(nèi)穩(wěn)定。
試劑：
1、乙酸銨水溶液500g/L ： 2、1+4 鹽酸溶液:40ml稀釋至200ml
3、EDTA 飽和溶液: 常溫下溶解度是0.2g/L, EDTA二鈉鹽的溶解度較大，在22℃時，每100毫升水中可镕解11.1克，此溶液的濃度約為0.3moL/L-1。由于EDTA二鈉鹽水溶液中主要是H2Y2-，所以溶液的pH值接近于4.42。其溶解度比較小 受溫度影響比較大長時間存放可認為其溶解度不變， 一般來說是用其鈉鹽酸化后制得飽和溶液。
4、硼標準使用液（10ppm）：
5、甲亞胺-H 酸顯色劑：準確稱取0.50g 甲亞胺-H 酸和2g 抗壞血酸溶于100mL 去離子水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。
測定：
準確移取HBO2標準使用液0 、0.1、0.3、0.625、1.25、2.5、7.5、15ml分別移入25ml比色管；
分別加入0.50mL EDTA 飽和溶液，2.5mL鹽酸溶液(1+4) ，5.0mL 乙酸銨溶液，搖勻后準確加入6.00mL 甲亞胺-H 酸顯色劑，搖勻并用去離水稀釋至標線，搖勻。
測量靜置暗處6h后，用10mm 比色皿于上海美析723N可見分光光度計于420mm 波長處以空白試驗溶液作參比測定吸光度
注意事項
(1) pH 對顯色反應(yīng)有影響適宜的pH 范圍在5.2~5.8
(2) 顯色劑甲亞胺-H 酸易氧化故應(yīng)保存在有塑料壓蓋的棕色瓶中試劑現(xiàn)用現(xiàn)配同時加入抗壞血酸
防止氧化
(3) 當(dāng)HB02 濃度在6.0mg/L 時，在50mL試液中加入6.0mL 的顯色劑是最佳的絡(luò)合比。
(4) 硬質(zhì)玻璃中常含有硼 試樣的預(yù)處理和顯色操作不能用玻璃器皿所使用的玻璃器皿不應(yīng)與試樣溶液作長時間接觸，用其他玻璃器皿時應(yīng)先進行全程序空白試驗用扣除空白的方法以消除玻璃器皿的影響
(5) 配制試劑用的水均需用石英蒸餾器重蒸餾過的水或用去離子水。
5分光光度法測定白花蛇舌草中的鈦含量
準確移取10ppm 的鈦標準使用液0, 1, 2，3, 4, 5 mL 分別置于25 mL 容量瓶中,
各加1∶1 鹽酸10mL、10% 抗壞血酸0.5 mL , 搖勻, 各加2% 二安替比林甲烷5mL , 用水稀釋至刻度, 搖勻靜置30 min 。波長為383 nm.
樣品加10% 抗壞血酸至完全褪色。加2% 二安替比林甲烷5mL , 用水稀至刻度, 搖勻。
1、鈦標準使用液（10ppm）； 2、鹽酸溶液1 mol/L：
3、二安替比林甲烷溶液2%: 準確稱取10.0g 二安替比林甲烷粉末, 用1 mol/L 的鹽酸溶液溶解并定容至500 mL。
6水中微量硅的硅鉬藍光度法測定
硅鉬藍光度法測定硅, 一般在較高酸度下正硅酸與鉬酸銨形成β型黃色硅鉬雜多酸, 用還原劑還原成藍色硅鉬藍, 在上海美析V723N可見分光光度計于波長810～820nm 進行光度法測定。目前, 已知的還原劑種類很多, 且各有優(yōu)缺點, 如氯化亞錫、硫酸亞鐵銨, 還原速度快、靈敏度高, 而穩(wěn)定性差; 抗壞血酸, 硅鉬藍很穩(wěn)定, 而還原速度太慢;硫酸亞鐵和草酸混合作還原劑, 混合液穩(wěn)定時間短; 胺基萘酚磺酸, 硅鉬藍穩(wěn)定時間雖長, 但易產(chǎn)生沉淀而還原能力降低; 米吐爾-Na 2SO3 作還原劑易產(chǎn)生沉淀, 還原速度較慢且不穩(wěn)定。本文研究和配制了甲醛合次硫酸氫鈉和亞硫酸鈉混合液, 作為水中微量硅的(硅鉬藍) 光度法測定的還原劑, 實驗證明其穩(wěn)定性、還原能力、靈敏度、準確度均較好, 還原劑可保存時間較長。
標準硅使用液（20ppm）:
鉬酸銨溶液: 稱取7.2 g 鉬酸銨于50mL 燒杯中, 加10mL 蒸餾水加熱溶解, 趁熱慢慢把它加入5mL濃硫酸和11mL 濃硝酸中, 攪拌均勻, 稍冷后用水稀釋至30mL, 如有渾濁, 放置過夜后過濾.
酒石酸溶液:21g/30ml
甲醛合次硫酸氫鈉(還原劑) 溶液: 稱取1.50 g 甲醛合次硫酸氫鈉和4.0 g 亞硫酸鈉于燒杯中, 加蒸餾水溶解至30mL, 貯于棕色帶滴管小瓶中。
測定：
準確吸取硅標準使用液0，0.2，0.5，0.7，0.9，1.2，1.5 mL 于25mL 比色管中,
加入0.2ml鉬酸銨, 搖勻, 放置4～5min,然后加入0.15ml酒石酸, 搖勻, 放置2min, 再加入0.4ml還原劑, 用蒸餾水稀至刻度, 搖勻, 置于沸水浴中加熱3～5min, 取出流水冷卻至室溫, 在上海美析V723N可見分光光度計于波長810～820nm 和1mL 比色皿中, 用試劑(或蒸餾水) 作參比,測其吸光度A值。
光度法同時側(cè)定磷和硅的研究
磷和硅與鉬酸銨都能生成黃色配合物, 此配合物與還原劑如能同時被還原為鉬藍, 但草酸能迅速破壞磷鉬黃, 且實驗表明, 在0～2ppm范圍內(nèi), 磷鉬藍和硅鉬藍的吸光度加合性良好。故在一定條件下, 先測出磷、硅都存在時的吸光度, 再在相同條件下, 加入草酸,
測出硅鉬藍的吸光度, 二者之差即為磷鉬藍的吸光度, 然后分別在其相應(yīng)的工作曲線上查出對應(yīng)的磷和硅的含量。
鉬酸銨溶液(2.5﹪)：
NaF(0.24﹪)-SnCL2(0.2﹪):2.4g NaF/100ml水，再加0.2g SnCL2,當(dāng)天使用。
草酸溶液（1﹪）：
硫酸（1mol/L）：
磷標準使用液（10ppm）
硅標準使用液（10ppm）
吸0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml的標準使用液于25ml比色管中，
加入1.2ml硫酸（1mol/L）,2.5ml的鉬酸銨溶液, 沸水浴加熱30秒, 10ml NaF(0.24﹪)-SnCL2(0.2﹪),冷卻后稀釋至刻度，搖勻。用1cm比色皿, 上海美析V723N可見分光光度計于690nm處, 以試劑空白為參比測量吸光度.
7鋁
試樣經(jīng)處理后，三價鋁離子在乙酸一乙酸鈉緩沖介質(zhì)中，與鉻天青S及溴化十六烷基三甲胺反應(yīng)形成藍色三元絡(luò)合物，于640nm波長處測定吸光度并與標準比較定量。
1、1%(體積分數(shù))硫酸:0.1ml稀釋至10ml.
2、乙酸一乙酸鈉溶液:稱40.8g乙酸鈉溶于540mL水中，加3.12ml冰乙酸，調(diào)pH至5.5，用水稀釋至600mL,
3、鉻天青S溶液(0.5 g/L):
4、溴化十六烷基三甲胺溶液(0.2 g/L):0.04g/200ml ,必要時加熱助溶。
5、抗壞血酸溶液（10g/L）:臨用時配。
6、鋁標準使用液（1.0ppm）：
應(yīng)保證試樣溶液中含1﹪硫酸.
吸取 0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,6.0m L鋁標準使用液(相當(dāng)于含0, 0.5, 1.0,2.0,4.0,6.0ug)分別置于25mL比色管中，依次向各管中加人1mL 1%硫酸溶液。
吸取1.0 mL消化好的試樣液，置于25mL比色管中。
向標準管、試樣管、試劑空白管中依次加人8.0 ml乙酸一乙酸鈉緩沖液,1.0 ml抗壞血酸溶液，混勻，加2.0 mL溴化十六烷基三甲胺溶液，混勻，再加2.0mL鉻天青S溶液，搖勻后，用水稀釋至刻度。室溫放置20min后，用1cm比色杯，于分光光度計上，以零管調(diào)零點，上海美析V723N紫外可見分光光度計于640 nm波長處測其吸光度，繪制標準曲線比較定量。
8鋅 ----雙硫腙比色法(一次提取)
樣品經(jīng)消化后,在pH4.0～5.5時,鋅離子與雙硫腙形成紫紅色絡(luò)合物,溶于四氯化碳，加入硫代硫酸鈉，防止銅、汞、鉛、鉍、銀和鎘等離子干擾，與標準系列比較定量。
二：試劑：
1.乙酸鈉溶液(2 mol/I):稱取68 g乙酸鈉(CH,COONa·3H,O)，加水溶解后稀釋至250 mL,
2.乙酸(2mol/L):量取10.0 mL冰乙酸，加水稀釋至85mL,
3.乙酸一乙酸鹽緩沖液:乙酸鈉溶液(2 mol/L)與乙酸(2 mol/L)等量混合，此溶液pH為4. 7左右。用二硫腺一四氯化碳溶液(0. 1 g/L)提取數(shù)次，每次10 mL,除去其中的鋅，至四氯化碳層綠色不變?yōu)橹?，棄去四氯化碳層，再用四氯化碳提取乙酸一乙酸鹽緩沖液中過剩的二硫蹤，至四氯化碳無色，棄去四氯化碳層。
4.硫代硫酸鈉溶液(250 g/L):乙酸鈉溶液(2 mol/L)與乙酸(2 mol/L)等量混合，此溶液pH為4. 7左右。用二硫腺一四氯化碳溶液(0. 1 g/L)提取數(shù)次，每次10 mL,除去其中的鋅，至四氯化碳層綠色不變?yōu)橹梗瑮壢ニ穆然紝?，再用四氯化碳提取乙酸一乙酸鹽緩沖液中過剩的二硫蹤，至四氯化碳無色，棄去四氯化碳層。
5. 1:1氨水
6.甲基橙指示液(2 g/L):稱取0.2 g甲基橙，用乙醇(20%)溶解并稀釋至100 Ml
7.鹽酸(2 mol/L):量取10 mL鹽酸，加水稀釋至60 mL,
8.鋅標準使用液（1.0ug）:
10. 二硫蹤一四氯化碳溶液(0.01g/L)。
吸取5.0～10.0mL定容的消化液和相同量的試劑空白液, 分別置于25mL比色管中；
吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL鋅標準使用液(相當(dāng)0、1、2、3、4、5μg鋅),分別置于25mL比色管中。
于樣品消化液、試劑空白液及鋅標準液中各加1滴甲基橙指示液，用氨水調(diào)至由紅變藍，再各加5mL乙酸-乙酸鹽緩沖液及1mL硫代硫酸鈉溶液混勻后, 各加10.0mL0雙硫腙-四氯化碳溶液，定容至25ml.劇烈振搖4min，靜置分層，經(jīng)脫脂棉將四氯化碳層濾入1cm比色杯中,以四氯化碳調(diào)節(jié)零點,于上海美析V723N可見分光光度計波長530nm處測吸光度,繪制標準曲線比較。
鋅試劑- 環(huán)己酮分光光度法測定乳制品奶粉中的鋅
吸取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0ml鋅標準液；
各加入2滴酚紅指示劑用氫氧化鈉(40 g/L)溶液調(diào)至紅色,再用鹽酸( 1+50)調(diào)至黃色,加入0.5克抗壞血酸, 5.0ml緩沖液, 2.0 ml氰化鉀溶液(10 g/L)和3.0 ml鋅試劑溶液再加入1.5 ml環(huán)己酮。混勻,放置15min用1 cm 比色皿,以試劑空白為參比于上海美析V723N可見分光光度計620 nm波長測定吸光度。
1、酚紅的乙醇溶液(1 g/L)：
2、氫氧化鈉(40 g/L)： 3、鹽酸(1+50)： 4、抗壞血酸
5、緩沖液：稱取42 g粒狀氫氧化鈉,溶于水, 加入155 g 硼酸, 溶解后再加純水至500 ml;所用試劑均為分析純,實驗用水為純水。
6、氰化鉀溶液(10 g/L)： 7、鋅標準使用液（10.0ppm）：
8、鋅試劑溶液：紫棕色結(jié)晶性粉末。溶于乙醇和堿，溶于氫氧化鈉呈紅色，不溶于水。遇鋅生成藍色化合物，稀時為溶液，濃時為深藍色沉淀。
9微波消解- 紫外分光光度法測定水中總氮
取一定量水樣于聚四氟乙烯密封消解罐中, 加水至25 mL, 搖勻。
分別取0.、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、12.0、13.0、15.0 mL氮標準使用液于聚四氟乙烯密封消解罐中, 加水至25 mL, 搖勻。
依次加入0.50 mL H2O2 , 0.50mL 9 mol/L硫酸溶液, 加蓋密封后于微波消解爐中10檔加熱8 min, 冷卻至室溫。注入10 mm石英比色皿中, 分別在上海美析UV762紫外可見分光光度計的220和275 nm處測定其吸光度, 用雙波長紫外分光光度法進行總氮測定。氮含量在0.024 2～9.60ppm之間時與吸光度成線性關(guān)系,以去離子水代替試樣做空白試驗。
過氧化氫是用于消解水中的有機物質(zhì)包括含氮有機物的, 因此其用量是一個重要的控制因素。實驗發(fā)現(xiàn), 在過氧化氫用量為0.40～0.80 mL之間吸光度基本保持不變,
酸性條件下, 過氧化氫具有較強的氧化性; 但酸性過強, 又不利于NH4+ 轉(zhuǎn)化為NO3- 。
1、氮標準使用液: 20 mg/L硝酸鉀標樣;
2、硫酸溶液（9 mol/L;）
3、過氧化氫溶液（0.3 g/mL）;
4、本實驗用水均為無氨水
10氟——灰化蒸餾— 氟試劑比色法
試樣經(jīng)硝酸鎂固定氟，經(jīng)高溫灰化后，在酸性條件下，蒸餾分離氟，蒸出的氟被氫氧化鈉溶液吸收，氟與氟試劑、硝酸鑭作用，生成藍色三元絡(luò)合物，與標準比較定量。
本方法所用水均為不含氟的去離子水，試劑為分析純，全部試劑貯于聚乙烯塑料瓶中。
1 丙酮:需500ml.
2 鹽酸(1+11):取10mL鹽酸，加水稀釋至120mL.
3 乙酸鈉溶液(250g/L)： 4 乙酸溶液(1mol/L):取3ml,稀釋至50mL.
5.氫氧化鈉溶液(40g/L)：
6 茜素氨羧合劑溶液: 現(xiàn)配。稱取0.19 g茜素氨羧絡(luò)合劑，加少量水及氫氧化鈉溶液(40 g/L)使其溶解，加0.125g 乙酸鈉，用乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為5.0(紅色)，加水稀釋至500ml。
7 硝酸鎂溶液(100 g/L):
8 硝酸鑭溶液: 現(xiàn)配。稱取0.11 g硝酸斕，用少量乙酸溶液溶解，加水至約225 ml，用乙酸鈉溶液(250 g/L)調(diào)節(jié)pH為5.0，再加水稀釋至250mL。
9 緩沖液(pH4. 7):稱取30 g無水乙酸鈉，溶于400 mL水中，加22 mL冰乙酸，再緩緩加冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4. 7，然后加水稀釋至500mL.
10 氫氧化鈉溶液(100 g/L):
11 酚酞一乙醇指示液(10 g/L):
12 硫酸(2+1):
13、氟標準使用液（5.0ppm）：
稱取混勻試樣5.00g (以鮮重計)，于30m1坩堝內(nèi)，加5.0 m L硝酸鎂溶液和0.5m L氫氧化鈉溶液(100 g/L)、使呈堿性，混勻后浸泡0.5 h，置水浴上蒸干，再低溫炭化，至完全不冒煙為止，移人馬弗爐中，600度灰化6h，取出，放冷。
于坩堝中加10m L水，將數(shù)滴硫酸(2十1)慢慢加人坩堝中，防止溶液飛濺，中和至不產(chǎn)生氣泡為止。將此液移人500mL蒸餾瓶中，用20mL水分數(shù)次洗滌坩堝，并入蒸餾瓶中。
于蒸餾瓶中加60mL硫酸(2+1)，數(shù)粒無氟小玻珠，連接蒸餾裝置，加熱蒸餾。餾出液用事先盛有5 mL水、7滴~20滴氫氧化鈉溶液(100 g/L)和1滴酚酞指示液的50mL燒杯吸收，當(dāng)蒸餾瓶內(nèi)溶液溫度上升至190℃時停止蒸餾(整個蒸餾時間約15 min-20 min),
取下冷凝管，用滴管加水洗滌冷凝管3次~4次，洗液合并于燒杯中。再將燒杯中的吸收液移人50 mL容量瓶中，并用少量水洗滌燒杯2次~3次，合并于容量瓶中。用鹽酸(1+11)中和至紅色剛好消失。用水稀釋至刻度，混勻。
吸取0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0 mL氟標準使用液(相當(dāng)0,1,3，5,7，9ug氟) 于25 mL帶塞比色管中。
分別吸取試樣蒸餾液各10.0 mL于25 mL帶塞比色管中。
各加2.OmL茜素氨羧絡(luò)合劑溶液、3.0 mL緩沖液、6.0 mL丙酮、2.0 m L硝酸鑭溶液，再加水至刻度，混勻，放置20m in，以3cm比色杯(參考波長580nm)用零管調(diào)節(jié)零點，測各管吸光度，繪制標準曲線比較。
葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下使鄰聯(lián)甲苯胺生成藍色物質(zhì)，此有色物質(zhì)在625nm 波長下與葡萄糖濃度成正比。通過測定藍色物質(zhì)的吸光度可計算樣品中葡萄糖的含量。
2.適用范圍
適用于谷類、乳類、飲料、酒類等食物樣品和血液樣品。檢出量為0.02 mg。
3.儀器
上海美析722分光光度計。
4.試劑：
除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。
（1） 乙醇。
（2） 40% 三氯乙酸：稱取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀釋至100ml。
（3） 2 mol/L NaOH 溶液：稱取8g NaOH， 用水溶解并稀釋至100ml。
（4） 1 % 鄰聯(lián)甲苯胺溶液：稱取0.1 g 鄰聯(lián)甲苯胺溶解于10 ml無水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。
（5） 乙酸緩沖液 （pH 5.0）：稱取14.28 g 乙酸鈉 （CH3COONa?3H2O）溶于水中，加入2.7 ml 冰乙酸，并調(diào)節(jié)pH 5.0， 用水定容至1 L。
（6） 葡萄糖氧化酶溶液：稱取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma 公司）用水溶解，使酶含量為100 U/ml。4 ℃ 冰箱保存一周。
（7） 過氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根過氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。
（8） 酶溶液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃ 冰箱可保存七周。
（9） 酶空白液：取100 ml 乙酸緩沖液，分別加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液、過氧化物酶溶液各1 ml，混勻。4℃ 冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）
（10） 葡萄糖標準液：將葡萄糖標準品（純度大于99%）于80 ℃干燥至恒量。精確稱取0.050 g，用水移入100 ml 容量瓶中，定容至刻度線。相當(dāng)于濃度為0.5 mg/ml。
5.操作步驟：
5.1樣品處理：
（1）固體樣品：稱取0.5～5g已粉碎的樣品于錐形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷卻后，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反復(fù)搖動混勻樣品，過濾，棄初始幾滴濾液。收集濾液。如果濾液澄清，可直接或經(jīng)進一步稀釋后用于測定。如果濾液渾濁，吸取20ml濾液轉(zhuǎn)移至另一容量瓶中，加入無水乙醇至刻度。混合后靜置至少30min。過濾，濾液用于測定。
（2） 液體樣品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml樣品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。靜置至少30min，過濾后濾液備用。（如果過濾后濾液仍渾濁，或樣液體積過少，可3000rpm離心15 min，上清液備用。）
（3） 新鮮牛乳等樣品：吸取0.5～2ml 樣品，用水稀釋，加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml，過濾。吸取5ml 濾液，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至中性，用水定容至10ml，備用。
（注：樣品處理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白質(zhì)，40% 三氯乙酸用于沉淀蛋白。）
5.2測定：標準管和樣品測定管，按下表所列操作（單位：ml）
試 劑 標準空白管 葡萄糖標準管 樣品空白管 樣品測定管
葡萄糖標準液 —— 0.1～0.5 —— ——
樣品提取液 —— —— 0.5 0.5
水 0.5 補至0.5 —— ——
酶溶液 5 5 —— 5
酶空白液 —— —— 5 ——
上述試劑混合后37℃ 水浴反應(yīng) 15 min， 625 nm 測定吸光度值。
（注意：葡萄糖與酶溶液的成色反應(yīng)與反應(yīng)時間密切相關(guān)，如反應(yīng)時間過長，溶液顏色會由藍轉(zhuǎn)變成灰色，并慢慢產(chǎn)生沉淀，所以反應(yīng)時間應(yīng)嚴格控制好。）
6.計算
根據(jù)吸光度值求出葡萄糖標準曲線的回歸方程，采用插入法求出樣品測定管中葡萄糖含量，再根據(jù)稀釋定容體積和稱樣量，計算出樣品中葡萄糖含量。
計算公式：
X= (As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中:
X——樣品中葡萄糖含量，g/100g;
As—— 由標準回歸方程求出的樣品測定管中葡萄糖含量，mg；
Ab——由標準回歸方程求出的樣品空白管中葡萄糖含量，mg；
V——樣品定容體積，ml；
F——稀釋倍數(shù)
0.5——測定時吸取樣品提取液的體積，ml；
m——樣品質(zhì)量，g；
0.1——將mg/g轉(zhuǎn)換成g/100g的系數(shù)。
7.注意事項
（1） 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反應(yīng)，特異性強，靈敏度高。
（2） 如果樣品提取液為無色，無需做樣品空白。但是有些樣品顏色很深，如飲料、菌藻類食物，或樣品提取液渾濁，往往干擾測定結(jié)果但又難以去除，所以測定這類樣品時需做樣品空白管以減少干擾。
此處介紹蔬菜中維生素K1的測定方法（HPLC法）和食物及飼料中水溶性維生素K3（甲萘醌）的測定方法
一、蔬菜中維生素K1的測定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的維生素K1經(jīng)有機溶劑提取后，經(jīng)失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁色譜柱進行凈化，再用液相色譜法將維生素K1分離并進行定性定量測定。
2.適用范圍
本標準適用于各類蔬菜、綠色植物及其干制品中維生素K1的測定。
3. 儀器：
（1） 實驗室常用設(shè)備
（2） 打碎機
（3） 202-R型恒溫干燥箱
（4） 色譜柱：為0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收縮變細，并裝有活塞，活塞上約1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm，柱上端膨大為容積約30ml的儲液池。使用前需干燥
（5） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器
與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶：具塞，圓底，容積為150ml。
（6） 恒溫水浴鍋
（7） 高純氮氣
（8） 高速離心機
與高速離心機配套的小離心管：具塞，容積為1.5～3.0ml。
（9） 上海美析UV762紫外分光光度計
（10） HPLC：高效液相色譜儀，帶紫外檢測器
4.試劑
除特殊說明實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純，有機溶劑使用前需重新蒸餾。
3.1 無水硫酸鈉：使用前需在150℃的烘箱內(nèi)烘烤4～8小時，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：稱取20g無水硫酸鈉，用蒸餾水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析純。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析純。
3.5 0.6mol/L碘化鉀溶液：稱取10g碘化鉀，用蒸餾水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：稱取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析純。不含過氧化物。
（1） 過氧化物的檢查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色。或加4滴5g/L淀粉液，水層呈藍色。則該乙醚含有過氧化物需處理后使用。
（2） 去除過氧化物的方法：重蒸時瓶中加一段純鐵絲，棄去10%初餾液和10%殘留液。
3.8 洗脫液：石油醚+乙醚（97+3）。
3.9 甲醇：優(yōu)級純。
3.10 正己烷：優(yōu)級純。
3.11 磷酸氫二鈉：分析純。
3.12 中性氧化鋁：100～200目。
3.13 氧化鋁的處理：
（1） 磷酸鹽處理氧化鋁：取250g中性氧化鋁，20g磷酸氫二鈉，1.6L蒸餾水，放入容積為2L的錐形瓶中沸水浴30min，不時搖動或攪拌。冷卻，倒掉上層液體（包括懸浮的細小顆粒），然后用布氏漏斗抽濾。將殘留物轉(zhuǎn)至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至兩次稱量相差3g以下，烘烤過程中不時攪拌，以避免結(jié)塊，冷卻后放入干燥器中保存。
（2） 失活處理氧化鋁：使用前，將磷酸鹽處理的氧化鋁，加入具塞錐形瓶中。每100g氧化鋁加9.0ml去離子水，蓋緊瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加熱3～5min，劇烈搖動錐形瓶，使氧化鋁可以自由流動，無結(jié)塊。冷卻，靜置30分鐘，使水分分布均勻。
（3） 驗證處理過的氧化鋁：取標準應(yīng)用液1.0ml，用氮氣吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3裝柱，將標準溶液加入柱上，按5.4凈化步驟進行柱色譜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集洗脫流出液，濃縮，氮氣吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC測定，記錄峰面積或峰高（A）。另取標準應(yīng)用液直接測定，記錄峰面積或峰高（Ar）。將A與Ar進行比較，其值在0.97～1.03之間（A/Ar），則說明柱效較好，氧化鋁處理合格。否則需重新進行失活處理。如果再次驗證比值仍不能達到0.97，則需重新制備氧化鋁。
3.14 維生素K1標準：Sigma公司，純度>98%。
3.15 標準貯備液：精確稱取50.0mg維生素K1標準，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。將儲備液分裝成安瓿，冷凍保存。
3.16 標準工作液：取標準貯備液， 用正己烷準確稀釋50倍, 即20.0μg/ml。
標準工作液的標定：取標準應(yīng)用液測定紫外吸光值，波長248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷為空白，測定3次，取平均值，按下式計算標準應(yīng)用液濃度。
X1 = A ×M ×103 ……………………………………(1)
E
式中： X1 -- 維生素K1標準應(yīng)用液濃度，μg/ml；
A -- 標準應(yīng)用液平均紫外吸光值；
E -- 摩爾消光系數(shù)，20,000；
M -- 維生素K1分子量450.7；
103 -- 換算成μg/ml的換算系數(shù)。
5.操作步驟
所有操作均需避光進行
5.1 樣品處理
（1） 新鮮蔬菜：揀凈去雜物，將可食部洗凈，擦去表面水分，切碎，用打碎機制備成勻漿。
（2） 干制植物性樣品：磨碎,過60目篩。
5.2 樣品提取
（1） 稱取已打成勻漿的新鮮樣品2～10g（維生素K1含量不低于2μg），加到具塞錐形瓶中,再加入5～10倍體積的丙酮,蓋上塞子,振搖3～5min，靜置1min，以下按5.3步驟操作。
（2） 稱取干制植物性樣品0.2～4g（維生素K1含量不低于2μg）,加到研缽中，再加入2～4倍于樣品量的無水Na2SO4研磨均勻后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，靜置1min。
（注：對于細胞壁比較厚的樣品，如藻類食品，可先用石英砂研磨，破壞植物組織細胞。石英砂需進行預(yù)處理，將石英砂用20目篩子過篩之后，先用濃鹽酸浸泡，然后再用稀氫氧化銨浸泡，最后用蒸餾水洗至中性后在烘箱中烤干。使用時，每10g樣品加3～5g石英砂于研缽中研磨。）
5.3 洗滌
將上部澄清液倒入已裝有50～100ml 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中，殘渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。殘渣繼續(xù)用石油醚洗滌3～4次，每次用量約25ml，至洗滌液呈無色，將洗滌液倒入同一分液漏斗中，振搖1min，靜置。棄水相，有機相用蒸餾水洗滌4～5遍，至水相澄清。棄水相，將有機相經(jīng)無水Na2SO4脫水后轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于60℃水浴中減壓蒸餾至約2ml時取下，立即用氮氣吹干，用石油醚定容至2.0 ml，待凈化。
5.4 裝柱
取干燥色譜柱，將驗證好的氧化鋁浸泡于石油醚中，濕法填充于色譜柱，使氧化鋁自由均勻流下，至柱高為20cm，其上端再加2 cm無水Na2SO4。打開活塞，調(diào)整流速為每秒1滴。一根色譜柱只用于一個樣品測定。
5.5 色譜凈化：待石油醚流至柱上端0.5cm時，加V1 ml樣品提取液，當(dāng)樣品液流至柱平齊時，加2 ml石油醚沖洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脫，2次，棄除流出液。然后，用30 ml洗脫液洗脫，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶收集流出液。流出液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮近干，取下用氮氣吹干后，用正己烷定容為V2 ml。將定容液移入小塑料離心管中，5000rpm離心5min，上清液供HPLC分析。
5.6 標準工作曲線的繪制
分別取維生素K1標準應(yīng)用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步驟提取，濃縮定容至2.0ml。取1.0ml標準提取液按5.4步驟操作，最后定容至1.0ml，即標準工作曲線中各點維生素K1含量分別相當(dāng)于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6條件進行HPLC測定，記錄峰面積或峰高。以標準含量為橫坐標，峰面積或峰高為縱坐標繪制標準工作曲線。
5.7 HPLC色譜分析
色譜條件（推薦條件）：
預(yù)柱ultrapack ODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流動相：甲醇+正己烷（98+2）?；靹?，臨用前脫氣。
進樣量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外檢測器：波長248nm。量程0.01～0.05。
HPLC穩(wěn)定性的測定：取標準應(yīng)用液連續(xù)進行6次HPLC測定，計算峰面積或峰高的平均值、標準差和RSD%，如果RSD<1%，說明儀器穩(wěn)定性良好。儀器穩(wěn)定后方可進行樣品測定。
5.8 樣品分析
取樣品凈化液20μl，按色譜條件進行定性、定量分析。
（1） 定性：用標準色譜峰的保留時間定性。
（2） 定量：用樣品峰面積或峰高在標準工作曲線上查出其相應(yīng)的維生素K1含量，或用回歸方程求出其含量。
6.計算
c×2×V2 ×100
X 2＝ ………………………………（2）
V1 ×m
式中： X2 -- 樣品中維生素K1的含量,μg/100g;
c -- 由標準工作曲線上查出或回歸方程求出的維生素K1含量,μg;
2 -- 樣品提取后的定容體積,ml;
V1 -- 樣品凈化處理時的取液量,ml;
V2 -- 樣品凈化后的定容體積,ml;
m -- 樣品質(zhì)量,g。
7. 注意事項
（1） 7.1允許差及最小檢出量: 同一實驗室同時或連續(xù)2次測定結(jié)果相對偏差絕對值≤10%，本法最小檢出限為0.5mg。
（2） 本方法避免使用皂化處理，減少了維生素K1的破壞；利用失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁進行色譜分離，通過改變洗脫液的極性使維生素K1與雜質(zhì)分離，有利于高效液相色譜對維生素K1的定性及定量分析。
（3） 維生素K1具有很強的親脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、異辛烷等溶劑中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶劑中。當(dāng)樣品中含有較多的水分時，如直接用石油醚或正己烷提取會使樣品變粘，因此，樣品需先用丙酮提取，或先用無水Na2SO4研磨，然后再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，進一步地破壞樣品的細胞組織，使提取效果更佳。
（4） 以往的報告多選用活性硅膠或中性氧化鋁做色譜柱分離維生素K1，再用極性小的有機溶劑作洗脫液。實際工作中發(fā)現(xiàn)，用硅膠色譜柱，洗脫流速慢，洗脫液用量大，分離時間較長；用未經(jīng)處理的氧化鋁色譜柱分離會出現(xiàn)維生素K1與干擾物分離不清的現(xiàn)象。當(dāng)氧化鋁用磷酸鹽處理后，氧化鋁的極性增強，使吸附較小的維生素K1易于被洗脫液洗脫出來，而且在處理后的氧化鋁中加入少量水分可以提高柱效，減少維生素K1出峰拖尾的現(xiàn)象，縮短保留了時間，避免了因使用氧化鋁造成的維生素K1可能分解的現(xiàn)象。
（5） 如果氧化鋁色譜柱柱效良好，首先被石油醚洗脫出來的應(yīng)是胡蘿卜素，且柱上沒有胡蘿卜素黃色帶擴散的現(xiàn)象；葉綠素及其他色素停留在色譜柱的上方?jīng)]有或僅有少量位移但不影響分離效果。
（6） 洗脫液中乙醚含量的多少影響著洗脫液的極性，如果乙醚含量少，可使維生素K1的保留時間延長，反之，會使干擾物質(zhì)被提前洗脫，影響凈化效果。所以應(yīng)嚴格控制洗脫液中乙醚的比例。
（7） 根據(jù)標準維生素K1紫外掃描圖譜，可見維生素K1于240，248nm，260，269nm波長處有4個特征峰，其中260nm的峰最低。將標準品用HPLC測定，以260nm波長下的峰面積為1，則240nm, 248nm和269nm波長下的峰面積分別為1.15，1.23，1.09。
（8） 一般反相色譜，多用有極性的甲醇作為流動相。在甲醇中加入適量的非極性有機溶劑（如正己烷、異辛烷等），可以增加維生素K1 的溶解能力，有利于縮短保留時間，減少出峰拖尾現(xiàn)象。本方法選擇甲醇+正己烷（98+2）作為流動相，維生素K1的保留時間為15.6±0.1min。
（9） 本方法最小檢測限為0.5μg/ml，在1.0～100.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積有良好的線形關(guān)系。批間測定結(jié)果的相對標準偏差在1.3～7.1% （n=6）；回收率為90.9～106.3%。。不同實驗室間測定結(jié)果表明此方法精密度、重現(xiàn)性較好，凈化效果好，試劑價格適中。
總膽堿的測定
比色法
1.原理
食物中的膽堿經(jīng)過堿處理提取后，通過Florisil柱色譜純化，然后用雷納克鹽（reineckate）與膽堿反應(yīng)形成粉紅色的膽堿-雷納克鹽復(fù)合物，這種復(fù)合物被丙酮洗脫后，在526nm有最大吸收，其吸收值與膽堿濃度成正比。
2.適用范圍
參照《Methods of Vitamin Assay》。使用于各類食物中膽堿的測定。最小檢出限為0.15mg。
3. 儀器與設(shè)備
（1） 實驗室常用設(shè)備。
（2） 回流提取裝置。
（3） 色譜柱：為0.8cm（內(nèi)徑）×30cm的玻璃柱，柱上端為容積30～50ml的儲液池，底端收縮變細，并裝有活塞?；钊霞s1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm。
（4） 上海美析723N可見分光光度計。
4. 試劑
除特殊說明外，所有試劑均為分析級，實驗用水為蒸餾水。
（1） 甲醇。
（2） 氯仿。
（3） 乙酸甲酯。
（4） 丙酮：用前重蒸餾。
（5） 10% 丙酮： 取50ml丙酮溶解于450ml水中。
（6） 冰乙酸。
（7） 冰乙酸-甲醇溶液：取50ml冰乙酸和400ml甲醇混合。
（8） 飽和氫氧化鋇提取液：于1000ml甲醇中加入40g無水Ba(OH)2，攪拌10min,再加入100ml氯仿，混合，使Ba(OH)2飽和，過濾去除多余的Ba(OH)2。
（9） 硅鎂吸附劑（Florisil）：Sigma 公司，60～100目。
（10） 雷納克銨（Ammonium Reineckate）飽和溶液：稱取2～3g雷納克銨，加入100ml水中，攪拌10min ,過濾去除多余的雷納克銨。實驗當(dāng)日配制。
（11） 膽堿標準貯備液（5g/L）：準確稱取無水氯化膽堿0.57613g，溶解于水中，并定容至100mL。冰箱保存。
（12） 膽堿標準工作液（1g/L）：準確吸取2.0ml標準貯備液，用水稀釋定容至100ml。
5.測定步驟
所有操作均需避光進行
5.1 提?。悍Q取適量樣品（約含5～50mg膽堿），置于100ml具塞錐型瓶中，加入30ml提取液，邊加邊搖，避免結(jié)塊。然后放置于76℃～80℃恒溫水浴回流2～4h，回流速度為1～2滴/秒。（注：加熱回流的溫度應(yīng)嚴格控制在80℃左右，否則樣品易撲濺，造成損失。樣品提取率與回流時間有關(guān)，回流2小時，提取率達到最高值，回流3～4小時，可以保證樣品提取較完全。）冷卻，樣品過濾至100ml容量瓶中，反復(fù)用5～10ml冰乙酸-甲醇溶液洗滌錐形瓶和濾渣，濾液并入容量瓶中。用pH試紙測定提取液pH在2～6范圍之內(nèi)（必要的話可加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH），然后用甲醇定容至刻度。
5.2 純化
（1） 填裝色譜柱：將硅鎂吸附劑浸入甲醇中，濕法將硅鎂吸附劑填充入色譜柱中（注：色譜柱最好經(jīng)過干燥處理，否則影響洗脫液流速），至硅鎂吸附劑的高度達10cm（約4g）。用甲醇沖洗色譜柱，并保持甲醇高于硅鎂吸附劑頂端0.5～1cm。
（2） 柱色譜純化：吸取一定量的提取液加到色譜柱中，打開底端活塞，使提取液靠重力作用通過色譜柱。先后用5ml，10ml甲醇洗滌色譜柱。待甲醇通過色譜柱后，依次用2份10ml乙酸甲酯，10ml冷的10%丙酮洗滌色譜柱。接著加入5ml雷納克銨飽和溶液（雷納克銨與吸附于色譜柱上的膽堿結(jié)合），待雷納克銨飽和溶液完全通過色譜柱后，用2份10ml冰乙酸洗滌直至流出液清亮為止（冰乙酸的作用是洗脫未與膽堿結(jié)合的過量的雷納克銨，應(yīng)注意洗脫完全）。用15ml丙酮洗脫色譜柱上膽堿-雷納克鹽復(fù)合物的粉紅色色譜帶，收集洗脫液，并用丙酮定容至15ml。
5.3 比色測定：用1cm比色杯，以丙酮調(diào)節(jié)零點，于526cm波長下，測定樣品吸光度，其值在標準工作曲線上查出，或通過回歸方程計算出對應(yīng)的膽堿含量，供計算使用。
5.4標準工作曲線：分別吸取0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml標準工作液（3.13），加至色譜柱上，按照上述樣品測定步驟操作。以膽堿含量做橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。
6.計算
C ×V1×100
X= -------- ×100
V2 × m
式中：
X--樣品中膽堿的含量，（mg/100g）；
C--從標準工作曲線或回歸方程中查到的膽堿含量，mg；
V1--樣品提取液的總體積，ml
V2--純化用提取液的體積，ml；
m--樣品質(zhì)量，g
7.注意事項
（1） 同一實驗室平行測定或重復(fù)測定結(jié)果的相對偏差絕對值＜10%。
（2） 硅酶吸附劑填充的高度關(guān)系到洗脫液的用量，如果填充過高，則應(yīng)加大洗脫液用量，以保證膽堿的純化和完全洗脫。
（3） 純化過程中冰乙酸的作用是將不能與膽堿形成復(fù)合物的多余雷納克銨鹽洗脫，丙酮則是洗脫膽堿-雷納克銨復(fù)合物，如果這兩步洗脫不完全，均影響膽堿的測定，所以必要時應(yīng)增加冰乙酸和丙酮的用量以保證測定結(jié)果。
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