紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)；紫外分光光度法；美析儀器www.antak.com.cn；UV-1700PC

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?span> 

?1、 學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理; 

?2、 掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù);  

?3、 掌握UV-1700PC紫外-可見分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。 

二、實(shí)驗(yàn)原理 

紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。 

進(jìn)行定性:利用紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較。      

定量分析: 紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當(dāng)入射光波長(zhǎng)λ及光程b一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度與它的濃度成線形關(guān)系。因此，通過測(cè)定溶液對(duì)一定波長(zhǎng)入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于最大吸收波長(zhǎng)λmax處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測(cè)量λmax的吸光度，以獲得最大靈敏度。 

光度分析時(shí)，分別將空白溶液和待測(cè)溶液裝入厚度為b的兩個(gè)吸收池中，讓一束一定波長(zhǎng)的平行單色光非別照射空白和待測(cè)溶液，以通過空白溶液的透光強(qiáng)度為I0，通過待測(cè)溶液的透光強(qiáng)度為I，根據(jù)上式，由儀器直接給出I0與I之比的對(duì)數(shù)值即吸光度。 

紫外-可見分光光度計(jì):紫外-可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計(jì)，它的主要部件有五個(gè)部分組成，即 

由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長(zhǎng)的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測(cè)器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號(hào)顯示器直接讀出吸光度A?？梢姽鈪^(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)原理：

（1）蛋白質(zhì)可作定量分析的原因：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在275 280nm具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。

（2）此種方法測(cè)量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn)的原因：由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收職也不同。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，濃度為1.0 mg/mL的1800種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280nm的吸光度在0.3—3.0之間，平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測(cè)量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn)。

（3）有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時(shí)的經(jīng)驗(yàn)公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm處來測(cè)量蛋白質(zhì)含量時(shí)，會(huì)有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260

(A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處測(cè)得的吸光度值)

還可以通過下述經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量：

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d

其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測(cè)得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm）;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子

（4）稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的經(jīng)驗(yàn)公式：蛋白質(zhì)的肽鍵在200—250nm有強(qiáng)的紫外吸收。其光吸收強(qiáng)度在一定范圍與濃度成正比，其波長(zhǎng)越短，光吸收越強(qiáng)。若選用215nm可減少干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長(zhǎng)測(cè)定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，因此，對(duì)稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式：

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

（A215和A225分別為蛋白質(zhì)溶液在215nm和225nm處測(cè)得的吸光度值）

三、儀器與試劑

儀器：UV-1700PC紫外-可見分光光度計(jì)，比色管（10ml的5個(gè)），吸量管。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：3.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。

四、實(shí)驗(yàn)步驟 

〈一〉   準(zhǔn)備工作 

1．啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動(dòng)工作站并初始化儀器。    

2. 在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目（光譜掃描，光度測(cè)量），本實(shí)驗(yàn)選擇光度測(cè)量，設(shè)置測(cè)量條件（測(cè)量波長(zhǎng)等）。 

3. 將空白放入測(cè)量池中，點(diǎn)擊START掃描空白，點(diǎn)擊ZERO校零。 

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。  

〈二〉測(cè)量工作  

1.吸收曲線的繪制:用吸量管吸取2mL3.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl

溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm～400nm區(qū)間，測(cè)量吸光度。   

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用吸量管分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 3.00 mg.mL^-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278 記錄所得讀數(shù)。

 3.樣品測(cè)定：取適量濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液3 mL，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻，按上述方法測(cè)定278nm處的吸光度。平行測(cè)定三份。

五、數(shù)據(jù)處理： 

1.以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長(zhǎng)。

由吸收曲線可得最大吸收波長(zhǎng)λmax=278nm

2.以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

待測(cè)蛋白質(zhì)的吸光度

平均濃度=0.641088  mg/mL

SD= 0.009434

RSD= 1.4715%

當(dāng)置信度為P=95%時(shí),f=2,t0.95,2=4.3

在誤差允許的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量為0.641088mg/mL

六、思考題

紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？受哪些因素的影響和限制？

答：優(yōu)點(diǎn)：方法操作簡(jiǎn)便、迅速、不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收利用，低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖溶液不干擾測(cè)定。

缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度和靈敏度差一點(diǎn)。干擾物質(zhì)多；對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中鉻氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生較大干擾。

干擾因素：主要受溶劑的影響。

七，實(shí)驗(yàn)總結(jié)與反思。

相比于上一個(gè)鄰二氮菲分光光度法測(cè)定微量鐵的實(shí)驗(yàn)來說，這個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作步驟是相當(dāng)?shù)暮?jiǎn)單，出錯(cuò)的幾率也小。最后測(cè)出樣品的吸光度要比另一組的大的原因，我想可能是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的問題，我們兩個(gè)小組用的不是一個(gè)容量瓶中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，他們組使用的是新配置的，我們小組使用的是之前遺留下來的，而且只剩下一點(diǎn)點(diǎn)，但是足夠我們做這次實(shí)驗(yàn)的量，我想很有可能是蛋白質(zhì)沉積在了底部，每次使用前沒有輕輕的混合均勻，導(dǎo)致底部濃度偏大，最后就影響到了我們待測(cè)溶液的濃度的測(cè)定。

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