紫外分光光度法粗多糖的測定

關鍵詞：紫外分光光度法；枸杞多糖；靈芝多糖；；美析儀器www.antak.com.cn；UV-1100;UV-1200

 

 

 

應用硫酸-苯酚比色法測食品中的粗多糖的含量而且分別用葡萄糖做標準品和用葡聚糖做標準品。結果表明前者測的結果稍偏高,大約高于4.8﹪。此方法簡便快捷,正確度高,重現(xiàn)性好,可適用于各種粗多糖的測定。

由十個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的碳水化合物稱為“多糖”。它一般都是自然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纖維兩大類?；钚远嗵菍Ｖ妇哂心撤N特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和殼聚糖等。這些多糖具有復雜的、多方面的生理活性和功能，如：免疫調(diào)節(jié)功能；抗腫瘤作用；延緩朽邁作用；降血脂、抗血栓作用等功能[1-2]，因而越來越引起人們的關注。

多糖的測定方法目前還沒有國家規(guī)定的方法,文獻報道的方法基本上是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，在作標準曲線大部分都是用葡萄糖來做標準品，而不是用葡聚糖（MW500，000），由于葡聚糖標準品在國內(nèi)難于獲得且價格昂貴。但是根據(jù)國內(nèi)外大量研究資料表明：香菇、金針菇、云芝、冬草、夏草、靈芝、茯苓、豬苓中所含的具有增強免疫、抑制腫瘤、鎮(zhèn)靜、強心、消炎等生理活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷鍵連接葡聚糖構成主鏈和支鏈，有的甚至就是β-葡聚糖，那么用葡萄糖作標準品和用葡聚糖作標準品往測食品中的多糖含量時是否有差別且差別為多少，本文以枸杞多糖和靈芝多糖來進行上述實驗。

1.材料與方法

1.1供試材料

枸杞多糖 (多糖含量在40-60﹪,其含量由國家檢測部分檢測)；

靈芝多糖 (多糖含量在40-60﹪,其含量由國家檢測部分檢測)；

葡聚糖（MW500，000）

1.2試劑

（1）銅儲備液：

稱取0.3gCuSO45H2O,3g檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至100ml，混勻，備用。

（2）銅試劑溶液：

取銅儲備液50ml，加水50ml，混勻后加進固體無水硫酸鈉12.5g并使其溶解。臨用新配。

（3）洗滌劑：

取水50ml,加進10ml銅試劑溶液，10ml氫氧化鈉溶液，混勻。

（4）乙醇溶液(80﹪)：20ml水中加進無水乙醇80ml，混勻。

（5）氫氧化鈉溶液(10﹪)：

稱取lOg氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至100ml，加進固體無水硫酸鈉至飽和，備用。

（6）硫酸溶液：

取10ml濃硫酸加進到80ml左右水中，混勻，冷卻后稀釋至100ml。

（7）苯酚溶液（5﹪）：

取苯酚100g，油浴蒸餾，收集180℃-182℃餾分。稱取精制苯酚5.0g，加進溶解并稀釋至100ml，混勻，溶液置冰箱中可保存一個月。

（8）葡萄糖/葡聚糖標準儲備溶液：

精密稱取在1050C于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖標準品1.0080g，加水溶解，并定容至100ml，混勻，置冰箱中保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。

（9）葡萄糖/葡聚糖標準使用溶液：

吸取葡萄糖/葡聚糖標準儲備溶液2.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。

1.3儀器

美析紫外分光光度計UV-1100;UV-1200

離心機

旋轉混勻器

1.4實驗方法

1.4.1 葡萄糖標準曲線制備

精密吸取葡萄糖標準使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相當于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg）分別置于25ml比色管中，正確補充水至2.0ml，加進苯酚溶液2.0ml，在旋轉混勻器上混勻，小心加進濃硫酸10ml，于旋轉混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計在490nm波優(yōu)點以試劑空缺溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。具體結果見表1。

表1 葡萄糖標準與濃度的關系

__________________________________________________________________

標準液(ml)  0    0.2    0.4    0.6    0.8   1.0

濃度(mg/ml) 0   0.02   0.04   0.06   0.08   0.10

吸光度(A)   0  0.166  0.343  0.514  0.690  0.882

___________________________________________________________________

以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪標準曲線（圖1）。

 

圖1 標準回回曲線方程圖

其回回方程Y=4.4122X-0.0147,相關系數(shù)r=0.9996。

1.4.2 葡聚糖標準曲線制備

精密吸取葡聚糖標準使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相當于葡聚糖0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mg）分別置于25ml比色管中，正確補充水至2.0ml，加進苯酚溶液2.0ml，在旋轉混勻器上混勻，小心加進濃硫酸10ml，于旋轉混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計在485nm波優(yōu)點以試劑空缺溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。具體結果見表2。

表2 葡聚糖標準與濃度的關系

______________________________________________________________________

標準液(ml)    0   0.2    0.4    0.6    0.8   1.0

濃度(mg/ml)   0  0.02   0.04   0.06   0.08   0.1

吸光度(A)     0  0.083  0.171  0.256  0.352  0.456

__________________________________________________________________

以葡聚糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線(見圖2)。

 

圖2 標準回回曲線方程圖

其回回方程Y=4.635X-0.0145,相關系數(shù)r=0.9983。

1.5樣品的測定

1.5.1樣品提取

稱取混合均勻的含粗多糖樣品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中,加水80ml左右,于沸水浴上加熱2h,冷卻至室溫后補加水至刻度,混勻,過濾,濾液供沉淀多糖。

1.5.2沉淀粗多糖

精密取1.5.1項下濾液4.0ml(V2)(作四組平行實驗)或液體樣品(V2)4.0ml(即被測多糖就是液體而不是固體樣品)置于50ml離心管中,加進無水乙醇16ml,混勻后,以4000rpm離心15min,棄往上清液。沉淀用乙醇溶液數(shù)毫升洗滌,離心后棄往上清液,反復3-4次操縱。接下來沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混勻后,供沉淀葡聚糖。

1.5.3沉淀葡聚糖

精密取1.5.2項溶液2ml(V4)置于20ml離心管中,加進NaOH溶液2.0ml,銅試劑溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷卻后以4000rpm離心15min,棄往上清液。沉淀用洗滌劑數(shù)毫升洗滌,離心后棄往上清液,反復3次操縱后,沉淀用硫酸溶液2.0ml溶解并轉移至50ml(V5)容量瓶中，加水淡薄至刻度，混勻。此溶液為樣品測定液。

1.5.4 測定

精密取1.5.3項的樣品測定液2.0ml(V6)置于25ml比色管中，加進苯酚溶液2.0ml,在旋轉混合器上混勻后,小心加進濃硫酸10.0ml后于旋轉混合器上混勻后,置于水浴中煮沸10min,冷卻至室溫用分光光度計在490nm波優(yōu)點,以試劑空缺為參比,1cm比色皿測定吸光度值，同時做樣品空缺實驗。從葡萄糖/葡聚糖標準曲線上查出葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量,再計算樣品中粗多糖含量(見表3)。

表3.以葡萄糖計和以葡聚糖計來確定粗多糖含量

_________________________________________________________________________________

編號 吸光度 樣品中枸杞多糖含量(mg/g) 樣品中靈芝多糖含量(mg/g)

______________ ________________________ _____________________

枸杞多糖 靈芝多糖 以葡萄糖計 以葡聚糖計 以葡萄糖計 以葡聚糖計

1  0.150    0.146     0.453      0.431       0.423      0.403

2  0.145    0.148     0.440      0.417       0.429      0.408

3  0.139    0.142     0.423      0.402       0.413      0.394

4  0.150    0.151     0.453      0.431       0.437      0.416

___________________________________________________________________________________

2.計算公式

X=(W1-W2)×V1×W3×W5/M×V2×V4×V6

式中: X-----樣品中粗多糖含量(以葡萄糖/葡聚糖計),mg/g

W1----樣品測定液中葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量,mg

W2--- 樣品空缺液中葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量,mg

M----樣品質(zhì)量，g

V1----樣品提取液總體積,ml

V2---沉淀粗多糖所用樣品提取液體積,ml

V3----粗多糖溶液體積,ml

V4---沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積,ml

V5---樣品測定液總體積,ml

V6---測定用樣品測定溶液體積，ml

3.穩(wěn)定性試驗

樣品顯色后,每隔一定時間測定吸光度,結果見表4。

表4 吸光度穩(wěn)定性試驗

________________________________________________________________________________

時間  10min   20min   30min    1h      1.5h      2h

A    0.150    0.151    0.148    0.151    0.150    0.147

____________________________________________________________________________________

結果表明，該顯色反應穩(wěn)定。

4．回收率測定（采用加樣回收法）

吸取多糖樣品溶液0.5ml，分別加進標準葡萄糖溶液0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml，分別置于25ml試管中，各加水1ml,加進苯酚溶液2ml，緩緩加濃硫酸10ml于旋轉混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計在485nm波優(yōu)點以試劑空缺溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。結果顯示回收率是93.15-99.7﹪。

5.小結

(1)由表3可知,用葡萄糖來做標準品和用葡聚糖做標準品測食品中的粗多糖含量時,前者測的結果稍偏高,大約高4.8﹪,但葡聚糖標準品的價格昂貴且在國內(nèi)難于買到,故可以用葡萄糖來代替葡聚糖做標準品。

(2)食品中分子量>10000的高分子物質(zhì)在80﹪乙醇溶液中沉淀，與水溶性單糖和低聚糖分離，用堿性二價銅試劑選擇性的從其它高分子物質(zhì)中沉淀具有葡聚糖結構的多糖，粗多糖在硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水天生糖醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測定樣品在粗多糖含量。

(3)此方法可很好的用于食品中粗多糖含量的測定，由于不需要對多糖進行純化和脫色處理。

(4)洗滌粗多糖沉淀時，一定要將離心管壁上玷污的其它糖分和碳水化合物用80％乙醇洗凈，否則結果會受影響。

 

 

關鍵詞：紫外分光光度法；枸杞多糖；靈芝多糖；；美析儀器www.antak.com.cn；UV-1100;UV-1200